포괄적인 단백질체학을 통해 무증상 및 증상이 있는 알츠하이머병에서 뇌 기반 뇌척수액 바이오마커가 밝혀졌습니다.

알츠하이머병(AD)에는 다양한 기본 병태생리학을 반영하는 단백질 바이오마커가 부족하여 진단 및 치료 진행을 방해합니다. 여기에서는 포괄적인 단백질체학을 사용하여 광범위한 AD 병태생리학을 나타내는 뇌척수액(CSF) 바이오마커를 식별합니다. 다중 질량 분석법은 AD CSF와 뇌에서 각각 약 3,500개와 약 12,000개의 단백질을 식별했습니다. 뇌 프로테옴의 네트워크 분석을 통해 44개의 생물 다양성 모듈이 해결되었으며, 그 중 15개는 뇌척수액 프로테옴과 겹쳤습니다. 이러한 중첩 모듈의 CSF AD 마커는 서로 다른 병태생리학적 과정을 나타내는 5개의 단백질 그룹으로 접혀 있습니다. AD 뇌의 시냅스와 대사산물은 감소하지만 뇌척수액은 증가하는 반면 뇌와 뇌척수액의 신경교가 풍부한 수초화 및 면역 그룹은 증가합니다. 패널 변경의 일관성과 질병 특이성은 500개 이상의 추가 CSF 샘플에서 확인되었습니다. 이들 그룹은 또한 무증상 AD의 생물학적 하위그룹을 식별했습니다. 전반적으로, 이러한 결과는 AD의 임상 적용을 위한 웹 기반 바이오마커 도구를 향한 유망한 단계입니다.
알츠하이머병(AD)은 전 세계적으로 신경퇴행성 치매의 가장 흔한 원인이며 시냅스 전달, 신경교 매개 면역 및 미토콘드리아 대사를 포함한 광범위한 생물학적 시스템 기능 장애를 특징으로 합니다(1-3). 그러나 확립된 단백질 바이오마커는 여전히 아밀로이드와 타우 단백질을 검출하는 데 초점을 맞추고 있어 이러한 다양한 병태생리학을 반영할 수 없습니다. 뇌척수액(CSF)에서 가장 확실하게 측정되는 이러한 "핵심" 단백질 바이오마커에는 (i) 피질 아밀로이드 플라크의 형성을 반영하는 아밀로이드 베타 펩타이드 1-42(Aβ1-42); (ii) 축색 변성의 징후인 총 타우; (iii) 병리학적 타우 과인산화를 대표하는 포스포-타우(p-tau)(4-7). 이러한 뇌척수액 바이오마커가 "현저한" AD 단백질 질환의 검출을 크게 촉진했지만(4-7), 이는 질병 이면에 있는 복잡한 생물학의 작은 부분일 뿐입니다.
AD 바이오마커의 병태생리학적 다양성 부족으로 인해 (i) AD 환자의 생물학적 이질성을 식별하고 정량화할 수 없음, (ii) 특히 전임상 단계에서 질병의 중증도 및 진행에 대한 불충분한 측정, 그리고 ( iii) 신경학적 악화의 모든 측면을 완전히 해결하지 못한 치료제의 개발. 관련 질병으로 인한 AD를 설명하기 위해 랜드마크 병리학에 의존하는 것은 이러한 문제를 악화시킬 뿐입니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 대부분의 치매 노인들은 인지 저하의 한 가지 이상의 병리학적 특징을 가지고 있습니다(8). AD 병리를 가진 개인의 90% 이상이 혈관 질환, TDP-43 봉입체 또는 기타 퇴행성 질환도 가지고 있습니다(9). 이러한 높은 병리학적 중복 비율은 치매에 대한 현재의 진단 체계를 혼란에 빠뜨리고 있으며, 이 질병에 대한 보다 포괄적인 병리생리학적 정의가 필요합니다.
다양한 알츠하이머병 바이오마커에 대한 필요성이 절실히 요구됨에 따라, 바이오마커 발굴을 위해 전체 시스템을 기반으로 한 “오믹스(omics)” 방법을 현장에서 채택하는 사례가 늘어나고 있습니다. AMP(Accelerated Pharmaceutical Partnership)-AD 연합은 2014년에 출범했으며 이 프로그램의 최전선에 있습니다. 국립보건원(National Institutes of Health), 학계 및 산업체의 이러한 다학제적 노력은 시스템 기반 전략을 사용하여 AD의 병태생리학을 더 잘 정의하고 생물다양성 진단 분석 및 치료 전략을 개발하는 것을 목표로 합니다(10). 이 프로젝트의 일환으로 네트워크 단백질체학은 AD의 시스템 기반 바이오마커 발전을 위한 유망한 도구가 되었습니다. 이러한 편견 없는 데이터 기반 접근 방식은 복잡한 단백질체학 데이터 세트를 특정 세포 유형, 세포 소기관 및 생물학적 기능과 관련된 공동 발현 단백질의 그룹 또는 "모듈"로 구성합니다(11-13). 정보가 풍부한 거의 12개의 네트워크 단백질체학 연구가 AD 뇌에 대해 수행되었습니다(13-23). 전반적으로, 이러한 분석은 AD 뇌 네트워크 프로테옴이 독립적인 코호트와 다중 피질 영역에서 고도로 보존된 모듈식 조직을 유지한다는 것을 나타냅니다. 또한 이러한 모듈 중 일부는 여러 질병의 병태생리학을 반영하여 데이터 세트 전체에서 AD 관련 풍부함의 재현 가능한 변화를 보여줍니다. 종합적으로, 이러한 발견은 AD의 시스템 기반 바이오마커로서 뇌 네트워크 프로테옴의 발견을 위한 유망한 기준점을 보여줍니다.
AD 뇌 네트워크 단백질체를 임상적으로 유용한 시스템 기반 바이오마커로 전환하기 위해 우리는 뇌 유래 네트워크와 AD CSF의 단백질체 분석을 결합했습니다. 이러한 통합적 접근 방식을 통해 시냅스, 혈관, 수초화, 염증 및 대사 경로 기능 장애를 비롯한 광범위한 뇌 기반 병태생리학과 관련된 다섯 가지 유망한 CSF 바이오마커 세트가 확인되었습니다. 우리는 다양한 신경퇴행성 질환의 500개 이상의 CSF 샘플을 포함하는 다중 복제 분석을 통해 이러한 바이오마커 패널을 성공적으로 검증했습니다. 이러한 검증 분석에는 무증상 AD(AsymAD) 환자의 CSF에서 그룹 표적을 검사하거나 정상적인 인지 환경에서 비정상적인 아밀로이드 축적의 증거를 보여주는 것이 포함됩니다. 이러한 분석은 AsymAD 모집단의 중요한 생물학적 이질성을 강조하고 질병의 초기 단계에서 개인을 아형화할 수 있는 패널 마커를 식별합니다. 전반적으로, 이러한 결과는 AD가 직면한 많은 임상 과제를 성공적으로 해결할 수 있는 다중 시스템을 기반으로 하는 단백질 바이오마커 도구 개발의 핵심 단계를 나타냅니다.
본 연구의 주요 목적은 AD를 유발하는 다양한 뇌 기반 병태생리학을 반영하는 새로운 뇌척수액 바이오마커를 식별하는 것입니다. 그림 S1은 (i) 여러 뇌 관련 CSF 질병 바이오마커를 식별하기 위한 AD CSF 및 네트워크 뇌 프로테옴의 예비 조사 결과를 기반으로 한 포괄적인 분석과 (ii) 후속 복제를 포함하는 연구 방법론을 간략하게 설명합니다. 유동 집단. 발견 중심 연구는 에모리 고이주에타 알츠하이머병 연구센터(ADRC)에서 인지적으로 정상인 20명과 AD 환자 20명을 대상으로 뇌척수액의 차등적 발현을 분석하는 것으로 시작되었습니다. AD의 진단은 뇌척수액에서 낮은 Aβ1-42와 높은 수준의 총 타우 및 p-타우가 존재하는 심각한 인지 장애로 정의됩니다[평균 몬트리올 인지 평가(MoCA), 13.8 ± 7.0][ELISA(ELISA )]] (표 S1A). 대조군(평균 MoCA, 26.7 ± 2.2)은 정상적인 수준의 CSF 바이오마커를 가졌습니다.
인간 CSF는 단백질 풍부도의 동적 범위를 특징으로 하며, 여기서 알부민 및 기타 극도로 풍부한 단백질은 관심 단백질의 검출을 방해할 수 있습니다(24). 단백질 발견의 깊이를 높이기 위해 질량 분석법(MS) 분석 전에 각 CSF 샘플에서 처음 14개의 매우 풍부한 단백질을 제거했습니다(24). 총 39,805개의 펩타이드가 MS에 의해 식별되었으며, 이는 40개 샘플의 3691개 프로테옴에 매핑되었습니다. 단백질 정량화는 다중 직렬 질량 태그(TMT) 라벨링에 의해 수행됩니다(18, 25). 누락된 데이터를 해결하기 위해 후속 분석에서 샘플의 50% 이상에서 정량화된 단백질만 포함하여 최종적으로 2875개의 프로테옴을 정량화했습니다. 총 단백질 풍부도 수준의 상당한 차이로 인해 대조 샘플은 통계적으로 이상치로 간주되어(13) 후속 분석에 포함되지 않았습니다. 나머지 39개 샘플의 존재비 값은 연령, 성별, 배치 공분산(13-15, 17, 18, 20, 26)에 따라 조정되었습니다.
회귀 데이터 세트에 대한 차별적 표현을 평가하기 위해 통계적 t-테스트 분석을 사용하여 이 분석은 대조군과 AD 사례 사이에서 풍부도 수준이 크게 변경된(P<0.05) 단백질을 식별했습니다(표 S2A). 그림 1A에 표시된 대로 AD에서는 총 225개 단백질의 풍부함이 크게 감소했으며, 303개 단백질의 풍부함은 크게 증가했습니다. 이러한 차별적으로 발현되는 단백질에는 미세소관 관련 단백질 타우(MAPT; P = 3.52 × 10-8), 신경필라멘트(NEFL; P = 6.56 × 10-3), 성장 관련 단백질 43과 같이 이전에 확인된 여러 뇌척수액 AD 마커가 포함됩니다. (GAP43; P = 1.46 × 10−5), 지방산 결합 단백질 3(FABP3; P = 2.00 × 10−5), 치티나제 3 유사 1(CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), 신경 그래눌린(NRGN; P = 3.43 × 10−4) 및 VGF 신경 성장 인자(VGF; P = 4.83 × 10−3)(4-6). 그러나 우리는 GDP 해리 억제제 1(GDI1; P = 1.54 × 10-10) 및 SPARC 관련 모듈 칼슘 결합 1(SMOC1; P = 6.93 × 10-9)과 같은 다른 매우 중요한 표적도 식별했습니다. 225개의 상당히 감소된 단백질에 대한 유전자 존재론(GO) 분석을 통해 스테로이드 대사, 혈액 응고 및 호르몬 활동과 같은 체액 과정과 밀접한 연관성이 있음이 밝혀졌습니다(그림 1B 및 표 S2B). 대조적으로, 303의 단백질이 크게 증가한 것은 세포 구조 및 에너지 대사와 밀접한 관련이 있습니다.
(A) 화산 플롯은 t-테스트에서 얻은 -log10 통계적 P 값(y축)을 기준으로 log2 배수 변화(x축)를 표시하며, 이는 컨트롤(CT)과 컨트롤(CT) 간의 차등 표현을 감지하는 데 사용됩니다. CSF 프로테옴의 AD 사례 모든 단백질 중. AD에서 유의하게 감소된 수준(P<0.05)을 갖는 단백질은 파란색으로 표시되는 반면, 질병에서 유의하게 증가된 수준을 갖는 단백질은 빨간색으로 표시됩니다. 선택한 단백질에는 라벨이 붙어 있습니다. (B) 단백질과 관련된 상위 GO 용어는 AD에서 크게 감소(파란색)하고 증가(빨간색)합니다. 생물학적 과정, 분자 기능 및 세포 구성 요소 분야에서 가장 높은 z-점수를 갖는 3가지 GO 용어를 보여줍니다. (C) MS는 CSF 샘플의 MAPT 수준(왼쪽)과 샘플 ELISA 타우 수준(오른쪽)과의 상관 관계를 측정했습니다. 관련 P 값과 Pearson 상관 계수가 표시됩니다. 하나의 AD 사례에 대한 ELISA 데이터가 부족하기 때문에 이 수치에는 분석된 39개 사례 중 38개에 대한 값이 포함됩니다. (D) 대조군에 대한 지도 클러스터 분석(P<0.0001, Benjamini-Hochberg(BH) 조정 P<0.01) 및 AD CSF는 데이터 세트에서 가장 크게 변화된 65개의 단백질을 사용하여 샘플을 발견했습니다. 표준화하고, 표준화하세요.
MAPT의 단백질 수준은 독립적으로 측정된 ELISA 타우 수준(r = 0.78, P = 7.8 × 10-9, 그림 1C)과 밀접한 관련이 있으며 MS 측정의 유효성을 뒷받침합니다. 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 수준에서 트립신 소화 후, Aβ1-40 및 Aβ1-42의 C-말단에 매핑된 이소형 특이적 펩타이드는 효율적으로 이온화될 수 없습니다(27, 28). 따라서 우리가 확인한 APP 펩타이드는 ELISA Aβ1-42 수준과 아무런 관련이 없습니다. 각 사례의 차등 발현을 평가하기 위해 우리는 P <0.0001 [FDR (false discovery rate) 보정 P <0.01]로 차별적으로 발현 된 단백질을 사용하여 샘플의 감독 클러스터 분석을 수행했습니다 (표 S2A). 그림 1D에 표시된 것처럼 이러한 65개의 매우 중요한 단백질은 대조군과 유사한 특성을 가진 한 가지 AD 사례를 제외하고 질병 상태에 따라 샘플을 올바르게 클러스터링할 수 있습니다. 이들 65개 단백질 중 63개는 AD에서 증가한 반면 단 2개(CD74 및 ISLR)만 감소했습니다. 전체적으로 이러한 뇌척수액 분석을 통해 질병 바이오마커 역할을 할 수 있는 AD의 수백 가지 단백질이 확인되었습니다.
그런 다음 AD 뇌 단백질체에 대한 독립적인 네트워크 분석을 수행했습니다. 이 발견의 뇌 코호트에는 대조군(n = 10), 파킨슨병(PD, n = 10), 혼합 AD/PD(n = 10) 및 AD(n = 10) 사례의 등외측 전두엽 피질(DLPFC)이 포함되었습니다. ) 샘플. 에메리 고이주에타 ADRC. 이 40개 사례의 인구통계는 이전에 설명되었으며(25) 표 S1B에 요약되어 있습니다. 우리는 TMT-MS를 사용하여 이러한 40개 뇌 조직과 27개 사례의 복제 코호트를 분석했습니다. 전체적으로 이 두 뇌 데이터 세트는 227,121개의 고유한 펩타이드를 생성했으며 이는 12,943개의 프로테옴에 매핑되었습니다(25). 최소 50%의 사례에서 정량화된 단백질만 후속 조사에 포함되었습니다. 최종 발견 데이터 세트에는 8817개의 정량화된 단백질이 포함되어 있습니다. 연령, 성별 및 사후 간격(PMI)을 기준으로 단백질 풍부 수준을 조정합니다. 회귀 후 데이터 세트의 차등 발현 분석은 2개 이상의 질병 집단에서 >2000 단백질 수준이 유의하게 변경되었음을 보여주었습니다[P<0.05, 분산 분석(ANOVA)]. 그런 다음 차등적으로 발현된 단백질을 기반으로 감독 클러스터 분석을 수행했으며 AD/대조군 및/또는 AD/PD 비교에서 P <0.0001을 수행했습니다(그림 S2, A 및 B, 표 S2C). 이러한 165개의 고도로 변형된 단백질은 대조군과 PD 샘플의 AD 병리학 사례를 명확하게 묘사하여 전체 프로테옴에서 강력한 AD 특이적 변화를 확인합니다.
그런 다음 WGCNA(Weighted Gene Co-expression Network Analysis)라는 알고리즘을 사용하여 발견된 뇌 프로테옴에 대한 네트워크 분석을 수행했습니다. 이 알고리즘은 데이터 세트를 유사한 발현 패턴을 가진 단백질 모듈로 구성합니다(11-13). 분석을 통해 가장 큰 것(M1, n = 1821 단백질)부터 가장 작은 것(M44, n = 34 단백질)까지 정렬되고 번호가 매겨진 44개의 모듈(M) 공동 발현 단백질이 확인되었습니다(그림 2A 및 표 S2D). 위에서 언급한 바와 같이 (13) 각 모듈의 대표적인 발현 프로파일 또는 특징적인 단백질을 계산하고 이를 질병 상태 및 AD 병리와 연관시키십시오. 즉, 알츠하이머병 등록부(CERAD)와 Braak Score의 연합을 확립하십시오(그림 2B). 전체적으로 17개 모듈은 AD 신경병리학과 유의미한 관련이 있었습니다(P <0.05). 이러한 질병 관련 모듈 중 상당수는 세포 유형별 마커도 풍부합니다(그림 2B). 위에서 언급한 것처럼(13), 세포 유형 농축은 모듈 중복과 세포 유형별 유전자의 참조 목록을 분석하여 결정됩니다. 이 유전자는 분리된 마우스 뉴런, 내피 및 신경교 세포의 공개된 데이터에서 파생됩니다. RNA 서열분석(RNA-seq) 실험(29).
(A) 뇌 프로테옴의 WGCNA를 발견합니다. (B) CERAD(Aβ 플라크) 및 Braak(타우 엉킴) 점수를 포함하여 AD 신경병리학적 특징(상단)을 갖는 모듈형 시그니처 단백질(모듈형 단백질 발현의 첫 번째 주요 구성요소)의 이중중간상관(BiCor) 분석. 양수(빨간색) 및 음수(파란색) 상관관계의 강도는 2색 히트맵으로 표시되며 별표는 통계적 유의성을 나타냅니다(P<0.05). Hypergeometric Fisher's Exact Test(FET)(하단)를 사용하여 각 단백질 모듈의 세포 유형 연관성을 평가합니다. 빨간색 음영의 강도는 세포 유형 농축 정도를 나타내고 별표는 통계적 유의성을 나타냅니다(P<0.05). BH 방법을 사용하여 FET에서 파생된 P 값을 수정합니다. (C) 모듈형 단백질의 GO 분석. 각 모듈 또는 관련 모듈 그룹에 대해 가장 밀접하게 관련된 생물학적 프로세스가 표시됩니다. 올리고, 희돌기아교세포.
밀접하게 관련된 5개의 성상교세포 및 소교세포가 풍부한 모듈(M30, M29, M18, M24 및 M5) 세트는 AD 신경병리학과 강한 양의 상관관계를 보여주었습니다(그림 2B). 온톨로지 분석은 이러한 신경교 모듈을 세포 성장, 증식 및 면역과 연결합니다(그림 2C 및 표 S2E). 두 개의 추가 신경교 모듈인 M8과 M22도 질병에서 강력하게 상향 조절됩니다. M8은 선천성 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 신호 전달 계통인 Toll 유사 수용체 경로와 매우 관련이 있습니다(30). 동시에 M22는 번역 후 수정과 밀접한 관련이 있습니다. 희소돌기아교세포가 풍부한 M2는 AD 병리와 강한 양의 상관관계를 보이며 뉴클레오시드 합성 및 DNA 복제와의 존재론적 연관성을 보여 질병에서 세포 증식이 강화되었음을 나타냅니다. 전반적으로, 이러한 발견은 우리가 이전에 AD 네트워크 프로테옴에서 관찰한 신경교 모듈의 상승을 뒷받침합니다(13, 17). 현재 네트워크의 많은 AD 관련 신경교 모듈은 대조군과 PD 사례에서 낮은 발현 수준을 보여 AD에서 증가하는 질병 특이성을 강조하는 것으로 나타났습니다(그림 S2C).
네트워크 프로테옴의 4개 모듈(M1, M3, M10 및 M32)만이 AD 병리와 강한 음의 상관관계가 있습니다(P <0.05)(그림 2, B 및 C). M1과 M3 모두 신경 마커가 풍부합니다. M1은 시냅스 신호와 밀접한 관련이 있는 반면, M3은 미토콘드리아 기능과 밀접한 관련이 있습니다. M10 및 M32에 대한 세포 유형 농축의 증거는 없습니다. M32는 M3와 세포 대사 사이의 연관성을 반영하는 반면, M10은 세포 성장 및 미세소관 기능과 밀접한 관련이 있습니다. AD와 비교하여 4개 모듈 모두 제어 및 PD가 증가하여 질병별 AD 변경 사항을 제공합니다(그림 S2C). 전반적으로, 이러한 결과는 이전에 AD에서 관찰된 뉴런이 풍부한 모듈의 풍부함이 감소했음을 뒷받침합니다(13, 17). 요약하자면, 우리가 발견한 뇌 프로테옴의 네트워크 분석은 이전 연구 결과와 일치하는 AD 특정 변경 모듈을 생성했습니다.
AD는 개인이 임상적 인지 저하 없이 아밀로이드 축적을 나타내는 초기 무증상 단계(AsymAD)를 특징으로 합니다(5, 31). 이 무증상 단계는 조기 발견 및 개입을 위한 중요한 창을 나타냅니다. 우리는 이전에 독립적인 데이터 세트에 걸쳐 AsymAD 및 AD 뇌 네트워크 프로테옴의 강력한 모듈식 보존을 입증했습니다(13, 17). 우리가 현재 발견한 뇌 네트워크가 이러한 이전 연구 결과와 일치하는지 확인하기 위해 27개 DLPFC 조직의 복제된 데이터 세트에서 44개 모듈의 보존을 분석했습니다. 이러한 조직에는 통제(n = 10), AsymAD(n = 8) 및 AD(n = 9) 사례가 포함됩니다. 대조군과 AD 샘플은 우리의 발견 뇌 코호트(표 S1B)의 분석에 포함된 반면 AsymAD 사례는 복제 코호트에서만 고유했습니다. 이러한 AsymAD 사례는 Emory Goizueta ADRC 두뇌 은행에서도 나왔습니다. 사망 당시 인지는 정상이었지만 아밀로이드 수치는 비정상적으로 높았다(평균 CERAD, 2.8±0.5)(표 S1B).
이들 27개 뇌 조직에 대한 TMT-MS 분석으로 11,244개의 프로테옴이 정량화되었습니다. 이 최종 개수에는 샘플의 최소 50%에서 정량화된 단백질만 포함됩니다. 이 복제된 데이터 세트에는 발견 뇌 분석에서 검출된 8817개의 단백질 중 8638개(98.0%)가 포함되어 있으며 대조군과 AD 코호트 사이에서 거의 3000개의 유의하게 변화된 단백질이 있습니다(P <0.05, 분산 분석을 위한 Tukey의 쌍 t 검정 이후)( 표 S2F). 이러한 차등적으로 발현된 단백질 중에서 910은 또한 AD와 뇌 프로테옴 대조 사례 사이에 유의미한 수준 변화를 나타냈습니다(P <0.05, ANOVA Tukey paired t-test 후). 이 910 마커는 프로테옴 간의 변화 방향에서 매우 일관적이라는 점은 주목할 가치가 있습니다(r = 0.94, P <1.0 × 10-200)(그림 S3A). 증가된 단백질 중에서 데이터 세트 간에 가장 일관된 변화를 보이는 단백질은 주로 신경교가 풍부한 M5 및 M18 모듈(MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 및 GFAP)의 구성원입니다. 감소된 단백질 중에서 가장 일관된 변화를 보이는 단백질은 거의 독점적으로 시냅스와 관련된 M1 모듈(NPTX2, VGF 및 RPH3A)의 구성원이었습니다. 우리는 웨스턴 블랏을 통해 midkine(MDK), CD44, 분비된 frizzled 관련 단백질 1(SFRP1) 및 VGF의 AD 관련 변화를 추가로 확인했습니다(그림 S3B). 모듈 보존 분석에 따르면 뇌 프로테옴에 있는 단백질 모듈(34/44)의 약 80%가 복제 데이터 세트(z-점수> 1.96, FDR 보정 P<0.05)에서 유의하게 보존된 것으로 나타났습니다(그림 S3C). 이 모듈 중 14개는 두 프로테옴 사이에 특별히 예약되었습니다(z-점수> 10, FDR 수정 P <1.0 × 10−23). 전반적으로, 뇌 프로테옴 간의 차등 발현 및 모듈 구성의 높은 수준의 일관성 발견 및 복제는 AD 전두엽 피질 단백질 변화의 재현성을 강조합니다. 또한 AsymAD와 더욱 진행된 질병이 매우 유사한 뇌 네트워크 구조를 가지고 있음도 확인했습니다.
뇌 복제 데이터 세트의 미분 표현에 대한 보다 자세한 분석은 AsymAD와 대조군 사이에 크게 변화된 총 151개의 단백질을 포함하여 AsymAD 단백질 변화의 상당한 정도를 강조합니다(P <0.05)(그림 S3D). 아밀로이드 부하와 일관되게 AsymAD 및 AD 뇌의 APP가 크게 증가했습니다. MAPT는 AD에서만 크게 변화하며, 이는 엉킴 수준의 증가 및 인지 저하와의 알려진 상관관계와 일치합니다(5, 7). 신경교가 풍부한 모듈(M5 및 M18)은 AsymAD에서 증가된 단백질에 크게 반영되는 반면, 뉴런 관련 M1 모듈은 AsymAD에서 감소된 단백질을 가장 대표합니다. 이러한 AsymAD 마커 중 다수는 증상이 있는 질병에서 더 큰 변화를 보여줍니다. 이러한 마커 중에는 M18에 속하는 신경교 단백질인 SMOC1이 있으며, 이는 뇌종양 및 눈과 사지의 발달과 관련이 있습니다(32). MDK는 M18의 또 다른 구성원인 세포 성장 및 혈관신생과 관련된 헤파린 결합 성장 인자입니다(33). 대조군과 비교하여 AsymAD는 크게 증가했고 이어서 AD도 더 크게 증가했습니다. 대조적으로, 시냅스 단백질 뉴로펜트락신 2(NPTX2)는 AsymAD 뇌에서 유의하게 감소되었습니다. NPTX2는 이전에 신경변성과 연관되어 있었고 흥분성 시냅스를 매개하는 역할이 인정되었습니다(34). 전반적으로, 이러한 결과는 질병의 중증도에 따라 진행되는 것으로 보이는 AD의 다양한 전임상 단백질 변화를 보여줍니다.
우리가 뇌 프로테옴의 발견에서 단백질 범위의 상당한 깊이를 달성했다는 점을 감안할 때, 우리는 네트워크 수준 AD 전사체와의 중첩을 더 완전히 이해하려고 노력하고 있습니다. 따라서 우리는 AD(n = 308) 및 대조군(n = 157) DLPFC 조직에서 18,204개 유전자의 마이크로어레이 측정을 통해 이전에 생성한 모듈과 발견한 뇌 프로테옴을 비교했습니다(13). 겹치는. 전체적으로 우리는 20개의 서로 다른 RNA 모듈을 식별했으며, 그 중 다수는 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 미세아교세포를 포함한 특정 세포 유형의 농축을 입증했습니다(그림3A). AD에서 이러한 모듈의 여러 변경 사항은 그림 3B에 표시됩니다. 더 깊은 비표지 MS 프로테옴(약 3000개 단백질)(13)을 사용한 이전의 단백질-RNA 중첩 분석과 일관되게, 우리가 발견한 뇌 프로테옴 네트워크의 44개 모듈 대부분은 전사체 네트워크에 상당한 중복이 없습니다. 뇌 프로테옴에 고도로 유지되는 34개 단백질 모듈을 발견하고 복제한 결과, 단지 14개(~40%)만이 피셔의 정확 테스트(FET)를 통과하여 전사체와 통계적으로 유의미한 중첩이 있는 것으로 나타났습니다(그림 3A). DNA 손상 복구(P-M25 및 P-M19), 단백질 번역(P-M7 및 P-M20), RNA 결합/접합(P-M16 및 P-M21) 및 단백질 표적화(P-M13 및 P-M20)와 호환됩니다. M23)은 전사체의 모듈과 겹치지 않습니다. 따라서 현재 중첩 분석에서는 더 깊은 프로테옴 데이터 세트가 사용되지만(13), 대부분의 AD 네트워크 프로테옴은 전사체 네트워크에 매핑되지 않습니다.
(A) 초기하형 FET는 AD 전사체(상단)의 RNA 모듈에서 세포 유형별 마커의 농축과 AD 뇌의 RNA(x축)와 단백질(y축) 모듈 사이의 중첩 정도를 보여줍니다. (맨 아래) . 빨간색 음영의 강도는 상단 패널의 세포 유형 농축 정도와 하단 패널의 모듈 중첩 강도를 나타냅니다. 별표는 통계적 유의성을 나타냅니다(P<0.05). (B) 각 전사체 모듈의 특징적인 유전자와 AD 상태 간의 상관 관계 정도. 왼쪽 모듈은 AD(파란색)와 가장 음의 상관관계가 있고, 오른쪽 모듈은 AD(빨간색)와 가장 양의 상관관계가 있습니다. 로그 변환된 BH 보정 P 값은 각 상관 관계의 통계적 유의성 정도를 나타냅니다. (C) 공유 세포 유형 강화가 포함된 중요한 중첩 모듈. (D) 중첩 모듈에서 표지된 단백질(x축)과 RNA(y축)의 log2 배수 변화에 대한 상관 분석. 관련 P 값과 피어슨 상관 계수가 표시됩니다. 미세아교세포, 미세아교세포; 천체, 성상교세포. CT, 통제.
대부분의 중첩되는 단백질 및 RNA 모듈은 유사한 세포 유형 농축 프로파일과 일관된 AD 변경 방향을 공유합니다(그림 3, B 및 C). 즉, 뇌 프로테옴(PM​1)의 시냅스 관련 M1 모듈은 3개의 뉴런이 풍부한 상동성 RNA 모듈(R-M1, R-M9 및 R-M16)에 매핑되어 있으며, 이는 모두 AD에 있음을 보여주었습니다. 감소된 수준. 마찬가지로 신경교가 풍부한 M5 및 M18 단백질 모듈은 성상교세포 및 소교세포 마커(R-M3, R-M7 및 R-M10)가 풍부한 RNA 모듈과 겹치며 질병에 크게 관여합니다. 두 데이터 세트 간의 이러한 공유 모듈 기능은 우리가 뇌 단백질체에서 관찰한 세포 유형 농축 및 질병 관련 변화를 추가로 지원합니다. 그러나 우리는 이러한 공유 모듈에서 개별 마커의 RNA와 단백질 수준 사이에 많은 중요한 차이점을 관찰했습니다. 이러한 중첩 모듈 내에서 분자의 프로테오믹스 및 전사체학의 차등 표현에 대한 상관 분석(그림 3D)은 이러한 불일치를 강조합니다. 예를 들어, APP 및 기타 여러 신경교 모듈 단백질(NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 및 SFRP1)은 AD 프로테옴에서 상당한 증가를 보였지만 AD 전사체에는 거의 변화가 없었습니다. 이러한 단백질 특이적 변화는 아밀로이드 플라크와 밀접하게 관련되어 있을 수 있으며(23, 35), 이는 프로테옴이 병리학적 변화의 근원임을 강조하며, 이러한 변화는 전사체에 반영되지 않을 수 있습니다.
우리가 발견한 뇌와 CSF 단백질체를 독립적으로 분석한 후, 우리는 뇌 네트워크의 병태생리학과 관련된 AD CSF 바이오마커를 식별하기 위해 두 데이터 세트에 대한 포괄적인 분석을 수행했습니다. 먼저 두 프로테옴의 중첩을 정의해야 합니다. CSF가 AD 뇌의 신경화학적 변화를 반영한다는 것이 널리 받아들여지고 있지만(4), AD 뇌와 CSF 단백질체 사이의 정확한 중첩 정도는 불분명합니다. 두 프로테옴에서 검출된 공유 유전자 산물의 수를 비교함으로써 우리는 뇌척수액에서 확인된 단백질의 거의 70%(n = 1936)가 뇌에서도 정량화되었음을 발견했습니다(그림 4A). 이러한 중첩 단백질(n = 1721)의 대부분은 Discovery Brain 데이터 세트의 44개 동시 발현 모듈 중 하나에 매핑됩니다(그림 4B). 예상대로 6개의 가장 큰 뇌 모듈(M1~M6)은 가장 많은 양의 CSF 중첩을 나타냈습니다. 그러나 예기치 않게 높은 수준의 중첩을 달성하는 더 작은 뇌 모듈(예: M15 및 M29)이 있는데, 이는 뇌 모듈 크기의 두 배보다 큽니다. 이는 우리가 뇌와 뇌척수액 사이의 중첩을 계산하기 위해 보다 상세하고 통계적으로 구동되는 방법을 채택하도록 동기를 부여합니다.
(A 및 B) 발견 뇌와 CSF 데이터 세트에서 검출된 단백질이 겹칩니다. 이러한 중첩 단백질의 대부분은 뇌 동시발현 네트워크의 44개 동시발현 모듈 중 하나와 연관되어 있습니다. (C) 뇌척수액 프로테옴과 뇌 네트워크 프로테옴 사이의 중첩을 발견합니다. 히트맵의 각 행은 초기하형 FET의 별도 중첩 분석을 나타냅니다. 맨 위 행은 뇌 모듈과 전체 CSF 프로테옴 사이의 중첩(회색/검은색 음영)을 나타냅니다. 두 번째 줄은 뇌 모듈과 CSF 단백질(빨간색 음영) 사이의 중첩이 AD에서 상당히 상향 조절된다는 것을 보여줍니다(P <0.05). 세 번째 줄은 뇌 모듈과 CSF 단백질(청색 음영) 사이의 중첩이 AD에서 상당히 하향 조절된다는 것을 보여줍니다(P <0.05). BH 방법을 사용하여 FET에서 파생된 P 값을 수정합니다. (D) 셀 유형 연관 및 관련 GO 용어를 기반으로 하는 접이식 모듈 패널. 이 패널에는 총 271개의 뇌 관련 단백질이 포함되어 있으며 CSF 단백질체에서 의미 있는 차등 발현이 있습니다.
단일 꼬리 FET를 사용하여 CSF 프로테옴과 개별 뇌 모듈 간의 단백질 중첩의 중요성을 평가했습니다. 분석에 따르면 CSF 데이터 세트의 총 14개 뇌 모듈에는 통계적으로 유의미한 중복(FDR 조정 P<0.05)이 있고 중복이 유의미한 추가 모듈(M18)(FDR 조정 P = 0.06)이 있는 것으로 나타났습니다(그림 4C). , 윗줄). 우리는 또한 차등적으로 발현된 CSF 단백질과 강하게 중첩되는 모듈에도 관심이 있습니다. 따라서 우리는 (i) CSF 단백질이 AD에서 크게 증가한 것과 (ii) CSF 단백질이 AD에서 크게 감소한 것을 확인하기 위해 두 가지 추가 FET 분석을 적용했습니다(P <0.05, paired t test AD/대조군). 의미 있는 중복이 있는 뇌 모듈 그들 사이. 그림 4C의 중간 및 하단 행에 표시된 것처럼 이러한 추가 분석은 44개의 뇌 모듈 중 8개가 AD CSF에 추가된 단백질(M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 및 M38)과 상당히 중첩된다는 것을 보여줍니다. . ), 단 두 개의 모듈(M6 및 M15)만이 AD CSF의 감소된 단백질과 의미 있는 중첩을 나타냈습니다. 예상대로 10개 모듈 모두 15개 모듈에 포함되어 CSF 프로테옴과 가장 많이 중복됩니다. 따라서 우리는 이들 15개 모듈이 AD 뇌 유래 CSF 바이오마커의 고수율 공급원이라고 가정합니다.
우리는 WGCNA 트리 다이어그램의 근접성과 세포 유형 및 유전자 온톨로지와의 연관성을 기반으로 이러한 15개의 중첩 모듈을 5개의 대형 단백질 패널로 접었습니다(그림 4D). 첫 번째 패널에는 뉴런 마커와 시냅스 관련 단백질(M1 및 M12)이 풍부한 모듈이 포함되어 있습니다. 시냅스 패널에는 총 94개의 단백질이 포함되어 있으며 CSF 프로테옴의 수준이 크게 변화하여 5개 패널 중 뇌 관련 CSF 마커의 가장 큰 공급원이 되었습니다. 두 번째 그룹(M6 및 M15)은 "상처 치유"(M6) 및 "체액성 면역 반응 조절"(M15)과 같은 내피 세포 마커 및 혈관체와의 밀접한 연관성을 입증했습니다. M15는 또한 내피세포와 밀접한 관련이 있는 지질단백질 대사와도 관련이 높습니다(36). 혈관 패널에는 뇌와 관련된 34개의 CSF 마커가 포함되어 있습니다. 세 번째 그룹에는 희돌기아교세포 마커 및 세포 증식과 유의미하게 관련된 모듈(M2 및 M4)이 포함됩니다. 예를 들어, M2의 최상위 온톨로지 용어에는 "DNA 복제의 긍정적인 조절"과 "퓨린 생합성 과정"이 포함됩니다. 한편, M4에는 "교세포 분화"와 "염색체 분리"가 포함됩니다. 수초화 패널에는 뇌와 관련된 49개의 CSF 마커가 포함되어 있습니다.
네 번째 그룹에는 가장 많은 모듈(M30, M29, M18, M24 및 M5)이 포함되어 있으며 거의 ​​모든 모듈에는 미세아교세포 및 성상교세포 마커가 상당히 풍부합니다. 수초화 패널과 유사하게 네 번째 패널에도 세포 증식과 밀접하게 관련된 모듈(M30, M29 및 M18)이 포함되어 있습니다. 이 그룹의 다른 모듈은 "면역 효과 과정"(M5) 및 "면역 반응 조절"(M24)과 같은 면역학적 용어와 관련이 높습니다. 신경교 면역 그룹에는 뇌와 관련된 42개의 CSF 마커가 포함되어 있습니다. 마지막 패널에는 4개 모듈(M44, M3, M33, M38)에 52개의 뇌 관련 마커가 포함되어 있으며, 모두 신체의 에너지 저장 및 대사와 관련되어 있습니다. 이들 모듈 중 가장 큰 모듈(M3)은 미토콘드리아와 밀접하게 관련되어 있으며 뉴런 특이적 마커가 풍부합니다. M38은 이 대사체의 작은 모듈 구성원 중 하나이며 중간 정도의 뉴런 특이성을 나타냅니다.
전반적으로, 이 5개 패널은 AD 피질의 광범위한 세포 유형과 기능을 반영하며 총체적으로 271개의 뇌 관련 CSF 마커를 포함합니다(표 S2G). 이러한 MS 결과의 타당성을 평가하기 위해 우리는 다중화 기능, 높은 민감도 및 특이성을 갖춘 직교 항체 기반 기술인 근접 확장 분석(PEA)을 사용하고 우리가 발견한 뇌척수액 샘플을 재분석했습니다. 이러한 271개 바이오마커의 하위 집합 (n = 36). 이 36개 목표는 MS 기반 결과(r = 0.87, P = 5.6 × 10-12)와 밀접한 관련이 있는 PEA의 AD 배수의 변화를 보여 주며, 이는 포괄적인 MS 분석 결과를 강력하게 검증했습니다(그림 S4). ).
시냅스 신호 전달부터 에너지 대사까지 우리의 5개 그룹이 강조하는 생물학적 주제는 모두 AD의 발병과 관련이 있습니다(1-3). 따라서 이러한 패널을 포함하는 15개 모듈은 모두 우리가 발견한 뇌 프로테옴의 AD 병리학과 관련이 있습니다(그림 2B). 가장 주목할만한 점은 신경교 모듈 간의 높은 긍정적 병리학적 상관관계와 가장 큰 신경 모듈(M1 및 M3) 간의 강한 부정적 병리학적 상관관계입니다. 복제된 뇌 프로테옴(그림 S3D)의 차등 발현 분석은 M5 및 M18 유래 신경교 단백질도 강조합니다. AsymAD 및 증상성 AD에서는 신경교 단백질과 M1 관련 시냅스 단백질이 가장 많이 감소합니다. 이러한 관찰은 우리가 5개 그룹에서 확인한 271개의 뇌척수액 표지가 초기 무증상 단계에서 발생하는 것을 포함하여 AD 피질의 질병 과정과 관련이 있음을 나타냅니다.
뇌와 척수액에서 패널 단백질의 변화 방향을 더 잘 분석하기 위해 우리는 15개의 중첩 모듈 각각에 대해 다음을 그렸습니다. (i) 뇌 데이터 세트에서 모듈 존재 수준을 찾았고 (ii) 모듈 단백질 차이는 뇌척수액에서 표현됩니다(그림 S5). 앞서 언급했듯이 WGCNA는 뇌의 모듈 풍부도 또는 특징적인 단백질 값을 결정하는 데 사용됩니다(13). 화산 지도는 뇌척수액(AD/대조군)에서 모듈 단백질의 차등적 발현을 설명하는 데 사용됩니다. 이 그림은 5개의 패널 중 3개가 뇌와 척수액에서 서로 다른 발현 경향을 나타냄을 보여줍니다. 시냅스 패널의 두 모듈(M1 및 M12)은 AD 뇌의 풍부도 수준의 감소를 보여 주지만 AD CSF의 증가된 단백질과 상당히 겹칩니다(그림 S5A). 대사체(M3 및 M38)를 포함하는 뉴런 관련 모듈은 유사한 뇌 및 뇌척수액 발현 패턴이 일치하지 않는 것으로 나타났습니다(그림 S5E). 혈관 패널은 또한 모듈(M6 및 M15)이 AD 뇌에서 적당히 증가하고 질병이 있는 CSF에서 감소했지만(그림 S5B) 다른 발현 경향을 보여주었습니다. 나머지 두 패널에는 두 구획 모두에서 단백질이 지속적으로 상향 조절되는 대규모 신경교 네트워크가 포함되어 있습니다(그림 S5, C 및 D).
이러한 추세는 이 패널의 모든 마커에 공통적으로 나타나는 것은 아닙니다. 예를 들어 시냅스 패널에는 AD 뇌와 CSF에서 크게 감소하는 여러 단백질이 포함되어 있습니다(그림 S5A). 이러한 하향 조절된 뇌척수액 마커 중에는 M1의 NPTX2 및 VGF와 M12의 크로모그라닌 B가 있습니다. 그러나 이러한 예외에도 불구하고 대부분의 시냅스 마커는 AD 척수액에서 상승합니다. 전반적으로 이러한 분석을 통해 5개 패널 각각에서 뇌 및 뇌척수액 수준의 통계적으로 유의미한 추세를 구분할 수 있었습니다. 이러한 추세는 AD에서 뇌와 CSF 단백질 발현 사이의 복잡하고 종종 다른 관계를 강조합니다.
그런 다음 처리량이 많은 MS 복제 분석(CSF 복제 1)을 사용하여 271개 바이오마커 세트를 가장 유망하고 재현 가능한 표적으로 좁혔습니다(그림 5A). CSF 사본 1에는 대조군, AsymAD 및 AD 코호트를 포함하여 Emory Goizueta ADRC의 총 96개 샘플이 포함되어 있습니다(표 S1A). 이러한 AD 사례는 경도 인지 저하(평균 MoCA, 20.0 ± 3.8)와 뇌척수액에서 확인된 AD 바이오마커의 변화를 특징으로 합니다(표 S1A). 우리가 발견한 CSF 분석과 달리, 이 복제는 개별 샘플의 면역 고갈이 필요 없는 단순화된 샘플 준비 프로토콜을 포함하여 보다 효율적이고 처리량이 높은 "단일 샷" MS 방법(오프라인 분류 없음)을 사용하여 수행됩니다. . 대신, 면역이 고갈된 단일 "강화 채널"이 덜 풍부한 단백질의 신호를 증폭하는 데 사용됩니다(37). 전체 프로테옴 적용 범위가 줄어들지만 이 단일 샷 방법은 기계 시간을 크게 줄이고 실행 가능한 분석이 가능한 TMT 표지 샘플의 수를 늘립니다(17, 38). 분석 결과 총 6,487개의 펩타이드가 확인되었으며, 이는 96개 사례에서 1,183개의 프로테옴에 매핑되었습니다. 우리가 발견한 CSF 분석과 마찬가지로 샘플의 50% 이상에서 정량화된 단백질만 후속 계산에 포함되었으며 데이터는 연령과 성별의 영향에 대해 회귀 분석되었습니다. 이로 인해 792개의 프로테옴이 최종 정량화되었으며, 그 중 95%가 발견된 CSF 데이터 세트에서도 확인되었습니다.
(A) 첫 번째 복제된 CSF 코호트에서 확인되고 최종 패널(n = 60)에 포함된 뇌 관련 CSF 단백질 표적. (B ~ E) 4개의 CSF 복제 코호트에서 측정된 패널 바이오마커 수준(복합 z-점수). 쌍을 이루는 t-검정 또는 Tukey 사후 보정이 포함된 ANOVA를 사용하여 각 반복 분석에서 존재비 변화의 통계적 유의성을 평가했습니다. CT, 통제.
우리는 포괄적인 분석을 통해 271개의 뇌 관련 CSF 표적을 검증하는 데 특히 관심이 있기 때문에 이 복제된 프로테옴에 대한 추가 조사를 이러한 마커로 제한할 것입니다. 이들 271개 단백질 중 100개는 CSF 복제 1에서 검출되었습니다. 그림 S6A는 대조 샘플과 AD 복제 샘플 사이의 이러한 100개 중첩 마커의 차등적 발현을 보여줍니다. 시냅스 및 대사산물 히스톤은 AD에서 가장 많이 증가하는 반면, 혈관 단백질은 질병에서 가장 많이 감소합니다. 100개의 중첩 마커(n = 70) 중 대부분은 두 데이터 세트에서 동일한 변화 방향을 유지했습니다(그림 S6B). 이들 70개의 검증된 뇌 관련 CSF 마커(표 S2H)는 이전에 관찰된 패널 발현 경향, 즉 혈관 단백질의 하향 조절 및 다른 모든 패널의 상향 조절을 크게 반영합니다. 검증된 70개의 단백질 중 10개만이 이러한 패널 추세와 모순되는 AD 풍부도의 변화를 보여주었습니다. 뇌와 뇌척수액의 전반적인 추세를 가장 잘 반영하는 패널을 생성하기 위해 최종 검증한 관심 패널에서 이러한 10가지 단백질을 제외했습니다(그림 5A). 따라서 우리 패널에는 궁극적으로 서로 다른 샘플 준비 및 MS 플랫폼 분석을 사용하여 두 개의 독립적인 CSF AD 코호트에서 검증된 총 60개의 단백질이 포함됩니다. CSF 사본 1 대조군 및 AD 사례에서 이러한 최종 패널의 z-점수 발현 플롯은 우리가 발견한 CSF 집단에서 관찰된 패널 추세를 확인했습니다(그림 5B).
이들 60개 단백질 중에는 많은 연구에서 AD와 연관된 전 염증성 사이토카인인 오스테오폰틴(SPP1)(39-41)과 시냅스 단백질인 GAP43과 같이 AD와 연관된 것으로 알려진 분자가 있습니다. 이는 분명히 신경변성과 연관되어 있습니다(42). 가장 완벽하게 검증된 단백질은 근위축성측삭경화증(ALS) 관련 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1) 및 파킨슨병 관련 탈수효소(PARK7)와 같은 기타 신경퇴행성 질환과 관련된 마커입니다. 우리는 또한 SMOC1 및 BASP1(뇌 풍부 막 부착 신호 전달 단백질 1)과 같은 다른 많은 마커가 신경 퇴행과의 이전 연결을 제한한다는 것을 확인했습니다. CSF 프로테옴의 전체적인 풍부도가 낮기 때문에 이 높은 처리량의 단일 검출 방법을 사용하여 MAPT 및 기타 특정 AD 관련 단백질(예: NEFL 및 NRGN)을 안정적으로 검출하기가 어렵다는 점은 주목할 가치가 있습니다. ) (43, 44).
그런 다음 세 번의 추가 반복 분석을 통해 60개의 우선 순위 패널 마커를 확인했습니다. CSF Copy 2에서는 단일 TMT-MS를 사용하여 Emory Goizueta ADRC(17)의 297개 대조군 및 AD 샘플로 구성된 독립적인 코호트를 분석했습니다. CSF 복제 3에는 스위스 로잔의 대조군 및 AD 환자 120명으로부터 이용 가능한 TMT-MS 데이터의 재분석이 포함되었습니다(45). 우리는 각 데이터세트에서 60개의 우선순위 마커 중 2/3 이상을 감지했습니다. 스위스 연구에서는 다양한 MS 플랫폼과 TMT 정량화 방법(45, 46)을 사용했지만 두 번의 반복 분석(그림 5, C 및 D, 표 S2, I 및 J)에서 패널 추세를 강력하게 재현했습니다. 우리 그룹의 질병 특이성을 평가하기 위해 TMT-MS를 사용하여 대조군(n = 18) 및 AD(n = 17) 사례뿐만 아니라 PD( n = 14)), ALS(n = 18) 및 전두측두엽 치매(FTD) 샘플(n = 11)(표 S1A). 우리는 이 코호트에서 패널 단백질의 거의 2/3(60개 중 38개)를 성공적으로 정량화했습니다. 이 결과는 5개 바이오마커 패널 모두에서 AD 특이적 변화를 강조합니다(그림 5E 및 표 S2K). 대사체 그룹의 증가는 가장 강한 AD 특이성을 나타냈고, 수초화 그룹과 신경교 그룹이 그 뒤를 이었습니다. 정도는 덜하지만 FTD는 이러한 패널 간에도 증가를 보여 주는데, 이는 비슷한 잠재적인 네트워크 변화를 반영할 수 있습니다(17). 대조적으로, ALS와 PD는 대조군과 거의 동일한 수초화, 신경교 및 대사체 프로파일을 보여주었습니다. 전반적으로, 샘플 준비, MS 플랫폼 및 TMT 정량화 방법의 차이에도 불구하고 이러한 반복 분석은 우리의 우선 패널 마커가 500개 이상의 고유한 CSF 샘플에서 매우 일관된 AD 특정 변화를 가지고 있음을 보여줍니다.
AD 신경변성은 인지 증상이 시작되기 몇 년 전에 널리 인식되어 왔기 때문에 AsymAD의 바이오마커에 대한 필요성이 시급합니다(5, 31). 그러나 점점 더 많은 증거에 따르면 AsymAD의 생물학은 동질적이지 않으며 위험과 회복력의 복잡한 상호 작용으로 인해 후속 질병 진행에 큰 개인차가 발생합니다(47). AsymAD 사례를 식별하는 데 사용되었지만 핵심 CSF 바이오마커(Aβ1-42, 총 타우 및 p-tau)의 수준은 누가 치매로 진행될지 신뢰성 있게 예측할 수 있는 것으로 입증되지 않았으며(4, 7), 더 많은 것을 나타낼 수 있습니다. 이 집단의 위험을 정확하게 계층화하기 위해서는 뇌 생리학의 다양한 측면을 기반으로 한 전체적인 바이오마커 도구를 포함하는 것이 필요합니다. 따라서 우리는 이후 CSF 사본 1의 AsymAD 모집단에서 AD 검증 바이오마커 패널을 분석했습니다. 이 31개의 AsymAD 사례는 비정상적인 핵심 바이오마커 수준(Aβ1-42/총 타우 ELISA 비율, <5.5)과 완전한 인지(평균 MoCA, 27.1)를 보여주었습니다. ± 2.2) (표 S1A). 또한 AsymAD를 앓고 있는 모든 개인의 임상 치매 점수는 0으로, 이는 일일 인지 또는 기능 수행 능력 저하의 증거가 없음을 나타냅니다.
먼저 AsymAD 코호트를 포함하여 96개의 CSF 반복실험 1개 모두에서 검증된 패널의 수준을 분석했습니다. 우리는 AsymAD 그룹의 여러 패널이 AD와 유사한 상당한 변화를 보였으며 혈관 패널은 AsymAD에서 하향 추세를 보인 반면 다른 모든 패널은 상승 추세를 보인 것을 발견했습니다(그림 6A). 따라서 모든 패널은 ELISA Aβ1-42 및 총 타우 수준과 매우 유의미한 상관관계를 보여주었습니다(그림 6B). 이에 비해 그룹과 MoCA 점수 간의 상관관계는 상대적으로 좋지 않습니다. 이러한 분석에서 가장 눈에 띄는 발견 중 하나는 AsymAD 코호트의 패널 풍부도가 광범위하다는 것입니다. 그림 6A에서 볼 수 있듯이 AsymAD 그룹의 패널 수준은 대개 대조군과 AD 그룹의 패널 수준을 교차하여 상대적으로 높은 변동성을 나타냅니다. AsymAD의 이질성을 더 자세히 조사하기 위해 우리는 96개의 CSF 복제 1 사례에 다차원 척도법(MDS) 분석을 적용했습니다. MDS 분석을 사용하면 데이터 세트의 특정 변수를 기반으로 사례 간의 유사성을 시각화할 수 있습니다. 이 클러스터 분석을 위해 CSF 발견 및 복제 1 프로테옴(n = 29)(표 S2L) 수준에서 통계적으로 유의미한 변화(P<0.05, AD/대조)가 있는 검증된 패널 마커만 사용합니다. 이 분석은 제어 케이스와 AD 케이스 사이에 명확한 공간 클러스터링을 생성했습니다(그림 6C). 대조적으로, 일부 AsymAD 사례는 대조군에 명확하게 밀집되어 있는 반면, 다른 사례는 AD 사례에 위치합니다. 이 AsymAD 이질성을 더 자세히 조사하기 위해 MDS 맵을 사용하여 AsymAD 사례의 두 그룹을 정의했습니다. 첫 번째 그룹에는 대조군(n = 19)에 더 가까운 AsymAD 사례가 포함되었으며, 두 번째 그룹은 AD에 더 가까운 마커 프로필(n = 12)을 가진 AsymAD 사례가 특징이었습니다.
(A) AsymAD를 포함하는 CSF 복제 1 코호트의 모든 96개 샘플에서 CSF 바이오마커 그룹의 발현 수준(z-점수). Tukey 사후 보정을 통한 분산 분석을 사용하여 패널 풍부도 변화의 통계적 유의성을 평가했습니다. (B) ELISA Aβ1-42 및 CSF 사본 1 샘플의 MoCA 점수 및 총 타우 수준과 패널 단백질 풍부 수준(z-점수)의 상관 분석. 관련 P 값과 Pearson 상관 계수가 표시됩니다. (C) 96개 CSF 사본 1 사례의 MDS는 29개의 검증된 패널 마커의 풍부도 수준을 기반으로 하며, 이는 발견 및 CSF 사본 1 데이터 세트 모두에서 크게 변경되었습니다[P<0.05 AD/대조군(CT)]. 이 분석은 AsymAD 그룹을 대조군(n = 19)과 AD(n = 12) 하위 그룹으로 나누는 데 사용되었습니다. (D) 화산 플롯은 두 개의 AsymAD 하위 그룹 사이의 -log10 통계적 P 값을 기준으로 log2 배수 변화(x축)를 갖는 모든 CSF 복제 1 단백질의 차등 발현을 보여줍니다. 패널 바이오마커는 색깔이 있습니다. (E) CSF 복제 1 풍부 수준의 선택 그룹 바이오마커는 AsymAD 하위그룹 간에 차등적으로 발현됩니다. Tukey의 사후 조정된 분산 분석을 사용하여 통계적 유의성을 평가했습니다.
우리는 이러한 대조군과 AD 유사 AsymAD 사례 사이의 차별적인 단백질 발현을 조사했습니다(그림 6D 및 표 S2L). 결과 화산 지도는 14개의 패널 마커가 두 그룹 간에 크게 변경되었음을 보여줍니다. 이러한 마커의 대부분은 시냅스와 대사체의 구성원입니다. 그러나 각각 미엘린 및 신경교 면역 그룹의 구성원인 SOD1 및 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 단백질 키나제 C 기질(MARCKS)도 이 그룹에 속합니다(그림 6, D 및 E). 혈관 패널은 또한 AE 결합 단백질 1(AEBP1)과 보체 계열 구성원 C9를 포함하여 AD 유사 AsymAD 그룹에서 크게 감소된 두 가지 마커에 기여했습니다. ELISA AB1-42(P = 0.38) 및 p-tau(P = 0.28)에서 대조군과 AD 유사 AsymAD 하위군 사이에는 유의미한 차이가 없었지만, 총 타우 수준(P = 0.0031)에서는 실제로 유의미한 차이가 있었습니다. ) (그림 S7). 두 AsymAD 하위 그룹 간의 변화가 전체 타우 수준(예: YWHAZ, SOD1 및 MDH1)보다 더 중요함을 나타내는 여러 패널 마커가 있습니다(그림 6E). 전반적으로, 이러한 결과는 당사의 검증된 패널이 무증상 질환 환자의 하위 유형 및 잠재적 위험 계층화를 할 수 있는 바이오마커를 포함할 수 있음을 나타냅니다.
AD 이면의 다양한 병태생리학을 더 잘 측정하고 표적화하기 위한 시스템 기반 바이오마커 도구가 시급히 필요합니다. 이러한 도구는 AD 진단 프레임워크를 변경할 뿐만 아니라 효과적인 환자별 치료 전략의 채택을 촉진할 것으로 예상됩니다(1, 2). 이를 위해 우리는 광범위한 뇌 기반 병태생리학을 반영하는 웹 기반 CSF 바이오마커를 식별하기 위해 AD 뇌 및 CSF에 편견이 없는 포괄적인 단백질체학 접근 방식을 적용했습니다. 우리의 분석은 (i) 시냅스, 혈관, 미엘린, 면역 및 대사 기능 장애를 반영하는 5개의 CSF 바이오마커 패널을 생성했습니다. (ii) 다양한 MS 플랫폼에서 강력한 재현성을 입증합니다. (iii) AD의 초기 및 후기 단계 전반에 걸쳐 진행성 질병 특이적 변화를 보여줍니다. 전반적으로, 이러한 발견은 AD 연구 및 임상 적용을 위한 다양하고 신뢰할 수 있는 웹 기반 바이오마커 도구의 개발을 향한 유망한 단계를 나타냅니다.
우리의 결과는 AD 뇌 네트워크 프로테옴의 고도로 보존된 조직을 보여주고 시스템 기반 바이오마커 개발을 위한 앵커로서의 사용을 지원합니다. 우리의 분석에 따르면 AD 및 AsymAD 두뇌를 포함하는 두 개의 독립적인 TMT-MS 데이터 세트는 강력한 모듈성을 가지고 있습니다. 이러한 발견은 우리의 이전 연구를 확장하여 전두엽, 두정엽 및 측두엽 피질의 여러 독립적인 코호트에서 2,000개 이상의 뇌 조직의 강력한 모듈이 보존되었음을 입증합니다(17). 이 합의 네트워크는 신경교가 풍부한 염증 모듈의 증가와 뉴런이 풍부한 모듈의 감소를 포함하여 현재 연구에서 관찰된 다양한 질병 관련 변화를 반영합니다. 현재 연구와 마찬가지로 이 대규모 네트워크는 AsymAD의 중요한 모듈 변경을 특징으로 하며 다양한 전임상 병리생리학을 보여줍니다(17).
그러나 이러한 매우 보수적인 시스템 기반 프레임워크 내에는 특히 AD 초기 단계의 개인들 사이에서 더욱 세밀한 생물학적 이질성이 있습니다. 당사의 바이오마커 패널은 AsymAD의 두 하위 그룹을 묘사할 수 있으며, 이는 여러 CSF 마커의 유의미한 차등 발현을 보여줍니다. 우리 그룹은 핵심 AD 바이오마커 수준에서는 명확하지 않았던 두 하위 그룹 간의 생물학적 차이를 강조할 수 있었습니다. 대조군과 비교하여, 이들 AsymAD 개체의 Aβ1-42/총 타우 비율은 비정상적으로 낮았습니다. 그러나 두 AsymAD 하위 그룹 간에는 총 타우 수준만 유의미한 차이가 있었던 반면, Aβ1-42와 p-tau 수준은 상대적으로 비슷한 수준을 유지했습니다. 높은 CSF 타우가 Aβ1-42 수준보다 인지 증상을 더 잘 예측하는 것으로 보이기 때문에(7), 두 AsymAD 코호트가 질병 진행의 위험이 다를 수 있다고 의심됩니다. AsymAD의 제한된 표본 크기와 종단적 데이터의 부족을 고려할 때 이러한 결론을 자신있게 도출하려면 추가 연구가 필요합니다. 그러나 이러한 결과는 시스템 기반 CSF 패널이 질병의 무증상 단계 동안 개인을 효과적으로 계층화하는 능력을 향상시킬 수 있음을 나타냅니다.
전반적으로, 우리의 발견은 AD의 발병기전에서 다양한 생물학적 기능의 역할을 뒷받침합니다. 그러나 조절되지 않은 에너지 대사는 검증된 5개 라벨링 패널 모두의 주요 주제가 되었습니다. 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 1(HPRT1) 및 젖산염 탈수소효소 A(LDHA)와 같은 대사 단백질은 가장 확실하게 검증된 시냅스 바이오마커이며, 이는 AD CSF의 증가가 재현성이 높은 성별임을 나타냅니다. 우리의 혈관과 신경교 패널에는 산화 물질의 대사와 관련된 여러 마커가 포함되어 있습니다. 이러한 발견은 뉴런의 높은 에너지 수요를 충족시킬 뿐만 아니라 성상교세포 및 기타 신경교세포의 높은 에너지 수요를 충족시키기 위해 대사 과정이 뇌 전체에서 수행하는 핵심 역할과 일치합니다(17, 48). 우리의 결과는 산화환원 전위의 변화와 에너지 경로의 중단이 미토콘드리아 장애, 신경교 매개 염증 및 혈관 손상을 포함하여 AD의 병인과 관련된 여러 주요 과정 사이의 핵심 연결이 될 수 있다는 증가하는 증거를 뒷받침합니다(49). 또한 대사성 뇌척수액 바이오마커에는 대조군과 AD 유사 AsymAD 하위 그룹 사이에 차별적으로 풍부한 단백질이 많이 포함되어 있어 이러한 에너지 및 산화환원 경로의 파괴가 질병의 전임상 단계에서 중요할 수 있음을 시사합니다.
우리가 관찰한 다양한 뇌 및 뇌척수액 패널 추세에는 흥미로운 생물학적 의미도 있습니다. 뉴런이 풍부한 시냅스와 대사체는 AD 뇌의 수준이 감소하고 뇌척수액의 풍부함이 증가함을 보여줍니다. 뉴런이 수많은 특수 신호에 에너지를 제공하기 위해 시냅스에서 에너지를 생성하는 미토콘드리아가 풍부하다는 점을 고려하면(50), 이 두 뉴런 그룹의 발현 프로필의 유사성은 예상됩니다. 뉴런의 손실과 손상된 세포의 돌출은 후기 질병의 이러한 뇌 및 뇌척수액 패널 경향을 설명할 수 있지만, 우리가 관찰하는 초기 패널 변화를 설명할 수는 없습니다(13). 초기 무증상 질환에서 이러한 발견에 대한 한 가지 가능한 설명은 비정상적인 시냅스 가지치기입니다. 마우스 모델의 새로운 증거는 미세아교세포 매개 시냅스 식균작용이 AD에서 비정상적으로 활성화되어 뇌의 초기 시냅스 손실을 초래할 수 있음을 시사합니다(51). 이렇게 버려진 시냅스 물질은 CSF에 축적될 수 있으며, 이것이 바로 뉴런 패널에서 CSF의 증가를 관찰하는 이유입니다. 면역 매개 시냅스 가지치기는 질병 과정 전반에 걸쳐 뇌와 뇌척수액에서 관찰되는 신경교 단백질의 증가를 부분적으로 설명할 수도 있습니다. 시냅스 가지치기 외에도 세포외유출 경로의 전반적인 이상으로 인해 신경 표지자의 뇌 및 뇌척수액 발현이 달라질 수도 있습니다. 많은 연구에서 AD 뇌의 발병 기전에서 엑소좀의 함량이 변경되었음을 보여주었습니다(52). 세포외 경로는 또한 Aβ의 증식에도 관여합니다(53, 54). 엑소좀 분비의 억제가 AD 형질전환 마우스 모델에서 AD 유사 병리를 감소시킬 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다(55).
동시에, 혈관 패널의 단백질은 알츠하이머병 뇌에서 완만하게 증가한 반면, 뇌척수액에서는 유의하게 감소했습니다. 혈액뇌장벽(BBB) ​​기능 장애는 이러한 발견을 부분적으로 설명할 수 있습니다. 많은 독립적인 사후 인간 연구에서 AD의 BBB 분해가 입증되었습니다(56, 57). 이 연구에서는 뇌 모세혈관 누출 및 혈액 매개 단백질의 혈관 주위 축적을 포함하여 단단히 밀봉된 내피 세포층을 둘러싼 다양한 비정상적인 활동을 확인했습니다(57). 이는 뇌의 혈관 단백질 증가에 대한 간단한 설명을 제공할 수 있지만, 뇌척수액에서 동일한 단백질의 고갈을 완전히 설명할 수는 없습니다. 한 가지 가능성은 중추신경계가 염증 및 산화 스트레스 증가 문제를 해결하기 위해 이러한 분자를 적극적으로 분리하고 있다는 것입니다. 이 패널에서 가장 심각한 CSF 단백질 중 일부, 특히 지단백질 조절과 관련된 단백질의 감소는 유해한 수준의 염증 억제 및 활성 산소종의 신경 보호 과정과 관련이 있습니다. 이는 순환계의 산화 스트레스 수준을 감소시키는 역할을 하는 지단백질 결합 효소인 파록소나제 1(PON1)의 경우에도 마찬가지입니다(58, 59). 알파-1-마이크로글로불린/비쿠닌 전구체(AMBP)는 혈관 그룹의 또 다른 상당히 하향 조절된 마커입니다. 이는 염증 억제 및 신경 보호에도 관여하는 지질 수송체 비쿠닌의 전구체입니다(60, 61).
다양한 흥미로운 가설에도 불구하고 생화학적 질병 메커니즘을 직접적으로 탐지할 수 없다는 점은 발견 중심의 단백질체학 분석의 잘 알려진 한계입니다. 따라서 이러한 바이오마커 패널의 메커니즘을 확실하게 정의하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. MS 기반 임상 분석의 개발을 향해 나아가기 위해 향후 방향에서는 선택적 또는 병렬 반응 모니터링과 같은 대규모 바이오마커 검증을 위한 표적화된 정량적 방법의 사용도 필요합니다(62). 우리는 최근 여기에 설명된 많은 CSF 단백질 변화를 검증하기 위해 병렬 반응 모니터링(63)을 사용했습니다. 시냅스, 대사 및 염증 패널에 각각 매핑되는 YWHAZ, ALDOA 및 SMOC1을 포함하여 여러 우선순위 패널 표적이 상당한 정확도로 정량화됩니다(63). DIA(독립적 데이터 수집) 및 기타 MS 기반 전략도 표적 검증에 유용할 수 있습니다. Budet al. (64) CSF 발견 데이터 세트에서 확인된 AD 바이오마커와 독립적인 DIA-MS 데이터 세트(3개의 서로 다른 유럽 집단의 거의 200개 CSF 샘플로 구성됨) 사이에 상당한 중복이 있다는 것이 최근 입증되었습니다. 이러한 최근 연구는 우리 패널이 신뢰할 수 있는 MS 기반 검출로 전환할 수 있는 잠재력을 뒷받침합니다. 전통적인 항체와 압타머 기반 검출은 주요 AD 바이오마커의 추가 개발에도 중요합니다. CSF의 풍부함이 낮기 때문에 처리량이 많은 MS 방법을 사용하여 이러한 바이오마커를 검출하는 것이 더 어렵습니다. NEFL과 NRGN은 저농도 CSF 바이오마커의 두 가지 예입니다. 이는 포괄적인 분석에서 패널에 매핑되지만 단일 MS 전략을 사용하면 안정적으로 감지할 수 없습니다. PEA와 같은 다중 항체를 기반으로 한 표적화 전략은 이러한 마커의 임상적 변형을 촉진할 수 있습니다.
전반적으로, 이 연구는 다양한 시스템을 기반으로 하는 CSF AD 바이오마커의 식별 및 검증을 위한 고유한 단백질체학 접근 방식을 제공합니다. 추가 AD 코호트 및 MS 플랫폼 전반에 걸쳐 이러한 마커 패널을 최적화하면 AD 위험 계층화 및 치료를 발전시킬 수 있는 가능성이 입증될 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 이러한 패널의 종단적 수준을 평가하는 연구는 초기 질병의 위험과 질병 중증도의 변화를 가장 잘 분류하는 지표 조합을 결정하는 데 중요합니다.
CSF에서 복사한 3개의 샘플을 제외하고 본 연구에 사용된 모든 CSF 샘플은 Emory ADRC 또는 밀접하게 관련된 연구 기관의 후원으로 수집되었습니다. 총 4개 세트의 Emory CSF 샘플이 이러한 단백질체학 연구에 사용되었습니다. CSF 코호트는 20명의 건강한 대조군과 20명의 AD 환자로부터의 샘플을 포함하는 것으로 밝혀졌습니다. CSF 사본 1에는 건강한 대조군 32명, AsymAD 개체 31명, AD 개체 33명의 샘플이 포함되어 있습니다. CSF 사본 2에는 147개의 대조군과 150개의 AD 샘플이 포함되어 있습니다. 다중 질병 CSF 복제 4 코호트에는 대조군 18개, AD 17개, ALS 19개, PD 13개 및 FTD 샘플 11개가 포함되었습니다. Emory University Institutional Review Board가 승인한 계약에 따라 모든 Emory 연구 참가자는 사전 동의를 얻었습니다. 2014년 알츠하이머병 센터를 위한 국립 노화 연구소 모범 사례 지침(https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html)에 따르면, 요추 천자를 통해 뇌척수액을 수집하고 저장했습니다. 대조군과 AsymAD 및 AD 환자는 Emory Cognitive Neurology Clinic 또는 Goizueta ADRC에서 표준화된 인지 평가를 받았습니다. 이들의 뇌척수액 샘플은 ELISA Aβ1-42, 총 타우 및 p-타우 분석을 위해 INNO-BIA AlzBio3 Luminex로 테스트되었습니다(65). ELISA 값은 확립된 AD 바이오마커 차단 기준에 기초하여 피험자의 진단 분류를 지원하는 데 사용됩니다(66, 67). 다른 CSF 진단(FTD, ALS, PD)에 대한 기본 인구통계 및 진단 데이터도 Emory ADRC 또는 제휴 연구 기관에서 얻습니다. 이러한 Emory CSF 사례에 대한 요약 사례 메타데이터는 표 S1A에서 찾을 수 있습니다. 스위스 CSF 복제 3 코호트의 특성은 이전에 발표되었습니다(45).
CSF가 샘플을 찾았습니다. CSF 데이터 세트의 발견 깊이를 높이기 위해 트립신 처리 전에 풍부한 단백질의 면역 소비가 수행되었습니다. 간단히 말해서, 40개의 개별 CSF 샘플에서 얻은 130μl의 CSF와 동일한 부피(130μl)의 High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin(Thermo Fisher Scientific, A36372)을 실험실의 스핀 컬럼(Thermo Fisher Scientific, A89868)에 넣었습니다. 온도 배양). 15분 동안 회전시킨 후 샘플을 1000g에서 2분간 원심분리합니다. 3K 초원심분리 필터 장치(Millipore, UFC500396)를 사용하여 14,000g에서 30분간 원심분리하여 유출 시료를 농축했습니다. 인산완충 식염수로 모든 샘플량을 75 μl로 희석합니다. 단백질 농도는 제조업체의 프로토콜(Thermo Fisher Scientific)에 따라 BCA(bicinchoninic acid) 방법으로 평가했습니다. 40개 샘플 모두의 면역고갈된 CSF(60μl)를 리실 엔도펩티다제(LysC) 및 트립신으로 분해했습니다. 즉, 샘플을 환원시키고 1.2 μl 0.5 M 트리스-2(-카르복시에틸)-포스핀 및 3 μl 0.8 M 클로로아세트아미드를 사용하여 90°C에서 10분간 알킬화한 다음 수조에서 15분간 초음파 처리했습니다. 샘플을 193μl의 8M 우레아 완충액[8M 우레아 및 100mM NaHPO4(pH 8.5)]으로 희석하여 최종 농도가 6M 우레아가 되도록 했습니다. LysC(4.5μg; Wako)는 실온에서 밤새 소화하는 데 사용됩니다. 그런 다음 샘플을 50mM 중탄산암모늄(ABC)을 사용하여 1M 요소로 희석했습니다(68). 동일한 양(4.5μg)의 트립신(Promega)을 첨가한 후 샘플을 12시간 동안 배양합니다. 소화된 펩타이드 용액을 최종 농도 1% 포름산(FA)과 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 산성화한 다음(66) 위에서 설명한 대로 50mg Sep-Pak C18 컬럼(Waters)을 사용하여 탈염합니다(25). . 이어서, 펩타이드를 50% 아세토니트릴(ACN) 1ml에서 용출시켰다. 배치(25개)에 걸쳐 단백질 정량화를 표준화하기 위해 모든 40개의 CSF 샘플에서 100μl 분취량을 결합하여 혼합 샘플을 생성한 다음 이를 5개의 글로벌 내부 표준(GIS)(48) 샘플로 나누었습니다. 모든 개별 샘플과 결합된 표준물질은 고속 진공(Labconco)으로 건조됩니다.
CSF가 샘플을 복사합니다. Dayon과 동료들은 이전에 CSF 사본 3 샘플의 면역 고갈 및 소화를 설명했습니다(45, 46). 나머지 복제 샘플은 개별적으로 면역이 고갈되지 않았습니다. 이전에 설명한 대로 제거되지 않은 샘플을 트립신으로 소화합니다(17). 각각의 반복 분석을 위해, 각 샘플에서 용출된 펩타이드의 120μl 분취량을 함께 모으고 동일한 부피의 분취량으로 나누어 TMT 표지된 전체 내부 표준으로 사용했습니다(48). 모든 개별 샘플과 결합된 표준물질은 고속 진공(Labconco)으로 건조됩니다. 저농도 CSF 단백질의 신호를 강화하기 위해 각 샘플에서 125μl를 결합하여 각 반복 분석에 대해 "향상된" 샘플을 준비했습니다.[즉, 연구 샘플을 모방한 생물학적 샘플이지만 사용 가능한 양은 훨씬 더 큼(37, 69)]이 혼합 CSF 샘플(17)에 병합되었습니다. 그런 다음 혼합된 샘플을 12ml의 High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin(Thermo Fisher Scientific, A36372)을 사용하여 면역 제거하고 위에서 설명한 대로 분해한 후 후속 다중 TMT 라벨링에 포함시켰습니다.