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호열성 미생물은 고온에서 번성하는 미생물입니다. 이를 연구하면 생명이 극한 상황에 어떻게 적응하는지에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나 기존의 광학현미경으로는 고온 조건을 달성하기가 어렵습니다. 국지적 저항 전기 가열을 기반으로 한 여러 가지 자체 제작 솔루션이 제안되었지만 간단한 상용 솔루션은 없습니다. 본 논문에서는 사용자의 환경을 온화하게 유지하면서 호열성 연구를 위한 높은 온도를 제공하기 위해 현미경 시야에 걸쳐 마이크로 스케일 레이저 가열 개념을 소개합니다. 생체 적합하고 효율적인 광 흡수체로서 금 나노 입자 코팅 기판을 사용하여 적당한 레이저 강도의 마이크로 스케일 가열을 달성할 수 있습니다. 미세 규모의 유체 대류, 세포 유지 및 원심 열영동 운동의 가능한 효과에 대해 논의합니다. 이 방법은 두 가지 종에서 입증되었습니다. (i) 약 65°C에서 번식하는 활성 호열성 박테리아인 Geobacillus stearothermophilus는 미세한 가열 하에서 발아, 성장 및 유영하는 것으로 관찰되었습니다. (ii) 최적의 고호열성 고세균인 Thiobacillus sp. 80°C에서. 이 연구는 현대적이고 저렴한 현미경 도구를 사용하여 호열성 미생물을 간단하고 안전하게 관찰할 수 있는 길을 열었습니다.
수십억 년에 걸쳐 지구상의 생명체는 때때로 인간의 관점에서 볼 때 극단적이라고 간주되는 광범위한 환경 조건에 적응하도록 진화해 왔습니다. 특히, 호열성 미생물이라 불리는 일부 호열성 미생물(박테리아, 고세균, 곰팡이)은 45°C ~ 122°C의 온도 범위에서 번성합니다1, 2, 3, 4. 호열성 생물은 심해 열수구, 온천 등 다양한 생태계에 서식합니다. 아니면 화산지대. 그들의 연구는 적어도 두 가지 이유로 지난 수십 년 동안 많은 관심을 불러일으켰습니다. 첫째, 예를 들어 호열성 물질 5, 6, 효소 7, 8 및 막 9가 어떻게 그렇게 높은 온도에서 안정한지, 호열성 물질이 어떻게 극심한 수준의 방사선을 견딜 수 있는지 등을 배울 수 있습니다10. 둘째, 이는 연료 생산13,14,15,16, 화학 합성(디히드로, 알코올, 메탄, 아미노산 등)17, 생물 채굴18 및 내열성 생체 촉매7,11 등 많은 중요한 생명공학 응용1,11,12의 기초입니다. 13. 특히, 현재 잘 알려진 PCR(Polymerase Chain Reaction)19은 최초로 발견된 호열성 세균 중 하나인 호열성 세균인 Thermus aquaticus에서 분리한 효소(Taq 중합효소)를 사용합니다.
그러나 호열성 물질에 대한 연구는 쉬운 작업이 아니며 어떤 생물학 실험실에서도 즉석에서 수행할 수 없습니다. 특히, 살아있는 호열균은 어떤 표준 광학현미경으로도 시험관 내에서 관찰할 수 없으며, 심지어 일반적으로 40°C 정도의 낮은 온도 등급으로 판매되는 가열 챔버를 사용하더라도 관찰할 수 없습니다. 1990년대 이후 고온 현미경(HTM) 시스템 도입에 전념한 연구 그룹은 소수에 불과했습니다. 1994년 Glukh et al. 가열/냉각 챔버는 혐기성 20을 유지하기 위해 닫힌 직사각형 모세관의 온도를 제어하는 펠티에 셀의 사용을 기반으로 고안되었습니다. 장치는 2°C/s의 속도로 최대 100°C까지 가열될 수 있어 저자는 고열성 박테리아 Thermotoga maritima21의 운동성을 연구할 수 있습니다. 1999년 Horn et al. 매우 유사한 장치가 개발되었으며, 여전히 세포 분열/연결을 연구하기 위한 상업용 현미경 검사에 적합한 가열된 모세관의 사용을 기반으로 합니다. 오랜 기간 동안 상대적으로 활동이 없었다가 효과적인 HTM에 대한 검색이 2012년에 재개되었습니다. 특히 Horn 등이 발명한 장치를 사용한 Wirth 그룹의 일련의 논문과 관련하여 더욱 그렇습니다. 15년 전, 고열균을 포함한 수많은 고세균의 운동성이 가열된 모세관을 사용하여 최대 100°C의 온도에서 연구되었습니다23,24. 그들은 또한 더 빠른 가열(설정 온도에 도달하는 데 35분이 아닌 몇 분)을 달성하고 매체 전체에 걸쳐 2cm 이상의 선형 온도 구배를 달성하기 위해 원래의 현미경을 수정했습니다. 이 온도 구배 형성 장치(TGFD)는 생물학적으로 관련된 거리 24, 25에서 온도 구배 내에서 많은 호열체의 이동성을 연구하는 데 사용되었습니다.
닫힌 모세관을 가열하는 것이 살아있는 호열균을 관찰하는 유일한 방법은 아닙니다. 2012년에 Kuwabara et al. 내열성 접착제(Super X2, Cemedine, Japan)로 밀봉된 집에서 만든 일회용 Pyrex 챔버를 사용했습니다. 샘플은 최대 110°C까지 가열할 수 있지만 원래 바이오이미징용으로 사용되지는 않았던 시중에서 판매되는 투명 가열판(Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) 위에 놓였습니다. 저자는 65°C에서 혐기성 호열성 박테리아(Thermosipho globiformans, 배가 시간 24분)의 효율적인 분열을 관찰했습니다. 2020년에는 Pulshen et al. 상업용 금속 접시(AttofluTM, Thermofisher)의 효율적인 가열은 뚜껑과 스테이지(PCR 기계에서 영감을 받은 구성)라는 두 가지 수제 가열 요소를 사용하여 시연되었습니다. 이러한 결합으로 인해 액체 온도가 균일해지고 뚜껑 바닥의 증발 및 응축이 방지됩니다. O-링을 사용하면 환경과의 가스 교환이 방지됩니다. Sulfscope라고 불리는 이 HTM은 75°C에서 Sulfolobus acidocaldarius를 이미지화하는 데 사용되었습니다.
이러한 모든 시스템의 인식된 한계는 공기 대물렌즈의 사용이 제한된다는 것입니다. 오일 침지는 이러한 고온 및 1mm 두께 이상의 투명 샘플을 통한 이미징에 적합하지 않습니다. 이러한 모든 시스템의 인식된 한계는 공기 대물렌즈의 사용이 제한된다는 것입니다. 오일 침지는 이러한 고온 및 1mm 두께 이상의 투명 샘플을 통한 이미징에 적합하지 않습니다. Обчепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, поскольку лубое имме рсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образиной > 1mm. 이러한 모든 시스템의 인식된 단점은 공기 대물렌즈 사용의 제한이었습니다. 오일 침지는 이러한 고온 및 두께가 1mm를 초과하는 투명한 샘플을 통한 시각화에 적합하지 않기 때문입니다.所有这些系统 的 一个 Public 认限 제조 是限 제조 기업 은 공기 자산 镜 , 任 何 油 浸 을 위한 高温 와 통신 으로 > 1 개의 제품 을 만드는 것입니다 . 이러한 모든 시스템의 인식된 한계는 공기 연행 거울을 사용하는 것의 한계입니다. 오일 침지는 이러한 고온에서 두께가 1mm를 초과하는 투명 샘플을 이미징하는 데 적합하지 않기 때문입니다. Обчепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, лубое иммерсионое погружение в масло непригодно для таких высоких температур 및 визуализации через прозрачные образцы толчиной >1mm. 이러한 모든 시스템의 알려진 단점은 공기 렌즈의 제한된 사용이며, 오일 침지는 두께가 1mm를 초과하는 투명한 샘플을 통한 고온 및 시각화에 적합하지 않습니다.최근에는 Charles-Orzag et al.에 의해 이 제한이 해제되었습니다. 28은 관심 있는 시스템 주변에 더 이상 열을 제공하지 않고 ITO(인듐-주석 산화물)로 만든 저항기의 얇고 투명한 층으로 덮인 커버 유리 자체 내부에 열을 제공하는 장치를 개발했습니다. 투명층에 전류를 흘려 뚜껑을 최대 75°C까지 가열할 수 있습니다. 그러나 작성자는 렌즈가 손상되지 않도록 렌즈를 대물렌즈에 가열해야 하지만 65°C를 넘지 않아야 합니다.
이러한 연구는 효율적인 고온 광학 현미경의 개발이 널리 채택되지 않았고, 종종 직접 만든 장비가 필요하며, 공간 분해능을 희생하여 달성되는 경우가 많다는 것을 보여줍니다. 이는 호열성 미생물이 몇 마리를 넘지 않는다는 점을 고려할 때 심각한 단점입니다. 마이크로미터. 감소된 가열량은 HTM의 세 가지 본질적인 문제, 즉 열악한 공간 분해능, 시스템 가열 시 높은 열 관성, 극한 온도에서 주변 요소(침수 오일, 대물 렌즈… 또는 사용자 손)의 유해한 가열을 해결하는 열쇠입니다. ).
본 논문에서는 저항 가열을 기반으로 하지 않는 호열체 관찰을 위한 HTM을 소개합니다. 대신, 우리는 빛을 흡수하는 기판에 레이저를 조사하여 현미경 시야의 제한된 영역 내에서 국부적인 가열을 달성했습니다. 온도 분포는 정량적 위상 현미경(QPM)을 사용하여 시각화되었습니다. 이 방법의 효과는 약 65°C에서 번식하고 짧은 배가 시간(약 20분)을 갖는 운동성 호열성 박테리아인 Geobacillus stearothermophilus와 80°C에서 최적으로 자라는 고열성 박테리아인 Sulfolobus shibatae(고세균)에 의해 입증됩니다. 설명하기 위해. 정상적인 복제 속도와 수영은 온도의 함수로 관찰되었습니다. 이 레이저 HTM(LA-HTM)은 커버슬립의 두께나 대물렌즈의 특성(공기 또는 오일 침지)에 의해 제한되지 않습니다. 이를 통해 시중에 판매되는 모든 고해상도 렌즈를 사용할 수 있습니다. 또한 열 관성으로 인해 가열이 느려지는 현상이 발생하지 않으며(밀리초 단위의 순간 가열 달성) 시중에서 판매되는 구성 요소만 사용합니다. 유일한 새로운 안전 문제는 장치 내부와 눈을 통과할 수 있는 강력한 레이저 빔(일반적으로 최대 100mW)의 존재와 관련되어 있으며 보호 고글이 필요합니다.
LA-HTM의 원리는 레이저를 사용하여 현미경의 시야 내에서 샘플을 국부적으로 가열하는 것입니다(그림 1a). 이를 위해서는 샘플이 빛을 흡수해야 합니다. 합리적인 레이저 출력(100mW 미만)을 사용하기 위해 액체 매질에 의한 빛의 흡수에 의존하지 않고 금 나노 입자로 기판을 코팅하여 샘플의 흡수를 인위적으로 증가시켰습니다(그림 1c). 빛으로 금 나노입자를 가열하는 것은 열 플라즈몬 분야에서 근본적으로 중요하며, 생물의학, 나노화학 또는 햇빛 수확29,30,31에 응용될 것으로 예상됩니다. 지난 몇 년 동안 우리는 물리학, 화학 및 생물학의 열 플라즈마 응용과 관련된 여러 연구에서 이 LA-HTM을 사용했습니다. 이 방법의 가장 큰 어려움은 최종 온도 프로파일을 표시하는 것입니다. 왜냐하면 상승된 온도는 샘플 내의 미세한 영역으로 제한되기 때문입니다. 우리는 2차원 회절 격자(교차 격자라고도 함)를 사용하는 간단하고 고해상도이며 매우 민감한 정량 위상 현미경 방법인 4파장 횡전단 간섭계를 사용하여 온도 매핑을 달성할 수 있음을 보여주었습니다. 33,34,35,36. 교차 격자 파면 현미경(CGM)을 기반으로 하는 이 열 현미경 기술의 신뢰성은 지난 10년 동안 출판된 12개의 논문에서 입증되었습니다37,38,39,40,41,42,43.
병렬 레이저 가열, 성형 및 온도 현미경 설치 계획. b 금 나노입자로 코팅된 커버슬립을 포함하는 AttofluTM 챔버로 구성된 샘플 형상. c 샘플을 자세히 살펴보십시오(축척이 아님). d는 균일한 레이저 빔 프로파일과 (e) 금 나노입자의 샘플 평면에서 시뮬레이션된 후속 온도 분포를 나타냅니다. f는 (g)에 표시된 결과 온도 분포의 시뮬레이션에 표시된 것처럼 균일한 온도를 생성하는 데 적합한 환형 레이저 빔 프로파일입니다. 스케일 바: 30μm.
특히 우리는 최근 LA-HTM 및 CGM을 사용하여 포유류 세포를 가열하고 37~42°C 범위에서 세포 열 충격 반응을 추적하여 이 기술을 단일 살아있는 세포 이미징에 적용할 수 있음을 입증했습니다. 그러나 고온에서 미생물 연구에 LA-HTM을 적용하는 것은 포유류 세포에 비해 더 많은 주의가 필요하기 때문에 분명하지 않습니다. 첫째, 배지 바닥을 수십도(몇도가 아닌) 가열하면 강한 수직 온도 구배. 기판에 단단히 부착되지 않은 경우 바람직하지 않은 움직임과 박테리아의 혼합을 유발할 수 있는 유체 대류(44)를 생성할 수 있습니다. 이러한 대류는 액체층의 두께를 줄임으로써 제거될 수 있습니다. 이를 위해 아래 제시된 모든 실험에서 박테리아 현탁액을 금속 컵 내부에 배치된 약 15μm 두께의 두 커버슬립 사이에 배치했습니다(AttofluTM, Thermofisher, 그림 1b,c). 원칙적으로 액체의 두께가 가열 레이저의 빔 크기보다 작으면 대류를 피할 수 있습니다. 둘째, 이렇게 제한된 기하학적 구조에서 작업하면 호기성 유기체가 질식할 수 있습니다(그림 S2 참조). 이 문제는 산소(또는 기타 필수 가스)에 투과 가능한 기판을 사용하거나, 커버슬립 내부에 갇힌 기포를 남겨두거나, 상단 커버슬립에 구멍을 뚫어 피할 수 있습니다(그림 S1 참조) 45. 본 연구에서는 후자의 솔루션을 선택했습니다(그림 1b 및 S1). 마지막으로, 레이저 가열은 균일한 온도 분포를 제공하지 않습니다. 동일한 강도의 레이저 빔(그림 1d)에서도 온도 분포는 균일하지 않고 오히려 열 확산으로 인해 가우스 분포와 유사합니다(그림 1e). 생물학적 시스템을 연구하기 위해 시야에서 정확한 온도를 설정하는 것이 목표인 경우 고르지 않은 프로파일은 이상적이지 않으며 박테리아가 기판에 부착되지 않으면 열영동 이동으로 이어질 수도 있습니다(그림 S3, S4 참조). 이를 위해 공간 광 변조기(SLM)를 사용하여 샘플 평면의 링 모양(그림 1f)에 따라 적외선 레이저 빔을 형성하여 주어진 기하학적 영역 내에서 완벽하게 균일한 온도 분포를 달성했습니다. 열 확산에도 불구하고(그림 1d) 39, 42, 46. 매체의 증발을 방지하기 위해 금속 접시(그림 1b) 위에 상단 커버슬립을 놓고 적어도 며칠 동안 관찰합니다. 이 상단 커버슬립은 밀봉되어 있지 않기 때문에 필요한 경우 언제든지 추가 매체를 쉽게 추가할 수 있습니다.
LA-HTM의 작동 방식을 설명하고 호열성 연구에서의 적용 가능성을 입증하기 위해 우리는 약 60-65°C의 최적 성장 온도를 갖는 호기성 박테리아인 Geobacillus stearothermophilus를 연구했습니다. 이 박테리아는 또한 편모와 수영 능력을 갖고 있어 정상적인 세포 활동의 또 다른 지표를 제공합니다.
샘플(그림 1b)을 60°C에서 1시간 동안 사전 배양한 다음 LA-HTM 샘플 홀더에 넣었습니다. 이 사전 배양은 선택 사항이지만 두 가지 이유로 여전히 유용합니다. 첫째, 레이저가 켜지면 세포가 즉시 성장하고 분열됩니다(보충 자료의 영화 M1 참조). 사전 배양이 없으면 샘플의 새로운 관찰 영역이 가열될 때마다 일반적으로 박테리아 성장이 약 40분씩 지연됩니다. 둘째, 1시간 사전 배양은 커버슬립에 대한 박테리아의 접착을 촉진하여 레이저가 켜졌을 때 열영동으로 인해 세포가 시야 밖으로 표류하는 것을 방지했습니다(보충 자료의 필름 M2 참조). 열영동은 일반적으로 뜨거운 것에서 차가운 것까지 온도 구배를 따라 입자 또는 분자가 이동하는 것이며 박테리아도 예외는 아닙니다43,47. 이러한 바람직하지 않은 효과는 SLM을 사용하여 레이저 빔을 형성하고 평평한 온도 분포를 달성함으로써 주어진 영역에서 제거됩니다.
그림에. 그림 2는 금 나노입자로 코팅된 유리 기판에 환형 레이저 빔을 조사하여 얻은 CGM으로 측정한 온도 분포를 보여줍니다(그림 1f). 레이저 빔이 조사된 전체 영역에서 평평한 온도 분포가 관찰되었습니다. 이 구역은 최적의 성장 온도인 65°C로 설정되었습니다. 이 영역 외부에서 온도 곡선은 자연스럽게 \(1/r\)로 떨어집니다(여기서 \(r\)는 방사형 좌표임).
환형 레이저 빔을 사용하여 금 나노 입자 층을 조사하여 원형 영역에 걸쳐 평평한 온도 프로파일을 얻은 CGM 측정의 온도 맵입니다. b 온도지도의 등온선 (a). 레이저 빔의 윤곽은 회색 점선 원으로 표시됩니다. 실험은 두 번 반복되었습니다(보충 자료, 그림 S4 참조).
LA-HTM을 사용하여 박테리아 세포의 생존력을 몇 시간 동안 모니터링했습니다. 그림에. 그림 3은 3시간 20분짜리 영화(영화 M3, 보충 정보)에서 촬영한 4개의 이미지에 대한 시간 간격을 보여줍니다. 레이저에 의해 정의된 온도가 최적인 65°C에 가까운 원형 영역 내에서 박테리아가 활발하게 증식하는 것이 관찰되었습니다. 대조적으로, 온도가 10초 동안 50°C 미만으로 떨어지면 세포 성장이 크게 감소했습니다.
서로 다른 시간에 레이저 가열 후 성장하는 G. stearothermophilus 박테리아의 광학 깊이 이미지, (a) t = 0분, (b) 1시간 10분, (c) 2시간 20분, (d) 3시간 20분 200 해당 온도 맵에 겹쳐진 1분짜리 필름(보충 정보에 제공된 M3 필름)에서 추출되었습니다. \(t=0\) 시간에 레이저가 켜집니다. 강도 이미지에 등온선이 추가되었습니다.
세포 성장과 온도에 대한 의존성을 더 정량화하기 위해 우리는 Movie M3 시야에서 초기에 분리된 박테리아의 다양한 콜로니의 바이오매스 증가를 측정했습니다(그림 4). 미니 콜로니 형성 단위(mCFU) 형성 시작 시 선택된 모 박테리아가 그림 S6에 표시되어 있습니다. 건조 질량 측정은 온도 분포를 매핑하는 데 사용된 CGM 48 카메라로 수행되었습니다. 건조 중량과 온도를 측정하는 CGM의 능력은 LA-HTM의 강점입니다. 예상대로 고온으로 인해 박테리아 성장이 더 빨라졌습니다 (그림 4a). 그림 4b의 세미 로그 플롯에서 볼 수 있듯이 모든 온도에서의 성장은 지수 함수 성장을 따르며, 여기서 데이터는 지수 함수 \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), 여기서 \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – 생성 시간(또는 두 배의 시간), \( g =1/ \tau\) – 성장률(단위 시간당 분할 수). 그림에. 도 4c는 온도의 함수로서 각각의 성장 속도 및 생성 시간을 보여준다. 빠르게 성장하는 mCFU는 2시간 후에 성장이 포화되는 것을 특징으로 하며, 이는 높은 박테리아 밀도로 인해 예상되는 행동입니다(전통적인 액체 배양의 정지기와 유사). 일반적인 형태 \(g\left(T\right)\)(그림 4c)는 약 60-65°C에서 최적의 성장률을 보이는 G. stearothermophilus의 예상되는 2단계 곡선에 해당합니다. 기본 모델(그림 S5)을 사용하여 데이터를 일치시킵니다. 여기서 \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, 이는 문헌에 인용된 다른 값과 잘 일치합니다49. 온도에 따른 매개변수는 재현 가능하지만 \({G}_{0}\)의 최대 성장률은 실험마다 다를 수 있습니다(그림 S7-S9 및 동영상 M4 참조). 보편적이어야 하는 온도 피팅 매개변수와 달리 최대 성장 속도는 관찰된 미세 규모 기하학적 구조 내에서 배지의 특성(영양분의 가용성, 산소 농도)에 따라 달라집니다.
a 다양한 온도에서 미생물 성장. mCFU: 미니어처 콜로니 형성 단위. 온도 구배에서 성장하는 단일 박테리아의 비디오에서 얻은 데이터(영화 M3). b (a)와 동일하며 반대수 척도입니다. c 선형 회귀(b)에서 계산된 성장률\(\tau\) 및 생성 시간\(g\). 수평 오류 막대: 성장 중에 mCFU가 시야로 확장되는 온도 범위입니다. 수직 오차 막대: 선형 회귀 표준 오차.
정상적인 성장 외에도 일부 박테리아는 레이저 가열 중에 때때로 눈에 띄었습니다. 이는 편모가 있는 박테리아의 예상되는 행동입니다. 추가정보에 나오는 영화 M5는 이러한 수영활동을 보여준다. 이 실험에서는 그림 1d, e 및 S3에 표시된 것처럼 균일한 레이저 방사선을 사용하여 온도 구배를 생성했습니다. 그림 5는 M5 영화에서 선택된 두 개의 이미지 시퀀스를 보여줍니다. 한 박테리아는 방향성 움직임을 보이는 반면 다른 모든 박테리아는 움직이지 않는 것을 보여줍니다.
두 시간 프레임(a)와 (b)는 점선 원으로 표시된 두 가지 다른 박테리아의 수영을 보여줍니다. 이미지는 M5 동영상(보충자료로 제공)에서 추출되었습니다.
G. stearothermophilus의 경우 레이저 빔을 켠 지 몇 초 후에 박테리아의 활발한 움직임(그림 5)이 시작되었습니다. 이 관찰은 Mora et al.에 의해 이미 관찰된 바와 같이 온도 증가에 대한 이 호열성 미생물의 시간적 반응을 강조합니다. 24 . LA-HTM을 사용하면 박테리아 운동성과 열주성(thermotaxis)에 대한 주제를 더 자세히 조사할 수 있습니다.
미생물의 수영을 다른 유형의 물리적 운동, 즉 (i) 명확한 방향이 없는 혼란스러운 운동으로 보이는 브라운 운동, (ii) 온도에 따른 규칙적인 운동 표류로 구성된 대류 50 및 열영동 43과 혼동해서는 안 됩니다. 구배.
G. stearothermophilus는 방어를 위해 불리한 환경 조건에 노출될 때 저항성이 높은 포자를 생성(포자 형성)하는 능력으로 알려져 있습니다. 다시 환경 조건이 좋아지면 포자가 발아하여 살아있는 세포를 형성하고 성장을 재개합니다. 이러한 포자형성/발아 과정은 잘 알려져 있지만, 실시간으로 관찰된 적은 없습니다. LA-HTM을 사용하여 우리는 G. stearothermophilus의 발아 사건에 대한 첫 번째 관찰을 여기에 보고합니다.
그림에. 도 6a는 13개 포자의 CGM 세트를 사용하여 얻은 광학 깊이(OT)의 저속 촬영 이미지를 보여줍니다. 전체 수집 시간(15시간 6분, \(t=0\) – 레이저 가열 시작) 동안 13개 포자 중 4개가 연속 시점 \(t=2\) h, \( 3\에서 발아했습니다. ) h \(10\)', \(9\) h \(40\)' 및 \(11\) h \(30\)'. 그림 6에는 이러한 이벤트 중 하나만 표시되어 있지만 보충 자료의 M6 동영상에서는 4개의 발아 이벤트를 관찰할 수 있습니다. 흥미롭게도 발아는 무작위로 나타납니다. 환경 조건의 동일한 변화에도 불구하고 모든 포자가 발아하는 것은 아니며 동시에 발아하지도 않습니다.
8개의 OT 이미지(오일 침지, 60x, 1.25 NA 목표)와 (b) G. stearothermophilus 집합체의 바이오매스 진화로 구성된 시간 경과. c (b) 성장률의 선형성을 강조하기 위해 반로그 척도로 그려졌습니다(점선).
그림에. 도 6b,c는 전체 데이터 수집 기간에 걸쳐 시간의 함수로서 시야 내 세포 집단의 바이오매스를 보여준다. 그림의 \(t=5\)h에서 관찰된 건조 질량의 빠른 붕괴. 6b, c는 시야에서 일부 셀이 빠져나가기 때문입니다. 이 네 가지 사건의 성장률은 \(0.77\pm 0.1\)h-1입니다. 이 값은 세포가 정상적으로 성장하는 그림 3.3 및 4와 관련된 성장률보다 높습니다. 포자에서 G. stearothermophilus의 성장률이 증가한 이유는 불분명하지만 이러한 측정은 LA-HTM에 대한 관심을 강조하고 단일 세포 수준(또는 단일 mCFU 수준)에서 작동하여 세포 생명의 역학에 대해 자세히 알아봅니다. .
LA-HTM의 다용성과 고온에서의 성능을 추가로 입증하기 위해 최적 성장 온도가 80°C51인 고열성 호산성 고세균인 Sulfolobus shibatae의 성장을 조사했습니다. G. stearothermophilus와 비교할 때, 이 고세균은 길쭉한 막대(간균)보다는 1 마이크론 구형(구균)과 유사한 매우 다른 형태를 가지고 있습니다.
그림 7a는 CGM을 사용하여 얻은 S. shibatae mCFU의 순차적 광학 깊이 이미지로 구성됩니다(보충 자료의 M7 장편 필름 참조). 이 mCFU는 최적 온도인 80°C보다 낮은 약 73°C에서 성장하지만 활발한 성장을 위한 온도 범위 내에 있습니다. 우리는 몇 시간 후에 mCFU를 고세균의 마이크로포도처럼 보이게 만드는 여러 핵분열 사건을 관찰했습니다. 이러한 OT 이미지에서 mCFU 바이오매스는 시간이 지남에 따라 측정되었으며 그림 7b에 표시되었습니다. 흥미롭게도 S. shibatae mCFU는 G. stearothermophilus mCFU에서 볼 수 있는 기하급수적 성장보다는 선형 성장을 보였습니다. 세포 성장 속도의 본질에 대해 오랜 논의가 있었습니다52. 일부 연구에서는 미생물의 크기에 비례하는 미생물 성장 속도(지수적 성장)를 보고하는 반면, 다른 연구에서는 일정한 속도(선형 또는 이중선형 성장)를 보여줍니다. Tzur et al.53이 설명했듯이 지수 성장과 (이)선형 성장을 구별하려면 바이오매스 측정에서 6% 미만의 정밀도가 필요하며 이는 간섭계를 포함하는 대부분의 QPM 기술로는 도달할 수 없습니다. Tzur et al.53이 설명했듯이 지수 성장과 (이)선형 성장을 구별하려면 바이오매스 측정에서 6% 미만의 정밀도가 필요하며 이는 간섭계를 포함하는 대부분의 QPM 기술로는 도달할 수 없습니다. Как объяснили Цур 및 dr.53, различение экспоненциального 및 (би)линейного rosta trебует точности <6% в измерениях биомасы, QPM의 메타데이터에 대해 더 이상 알 수 없으며, 이 정보는 인터페로미터에 따라 다릅니다. Zur et al.53이 설명했듯이 지수 성장과 (이)선형 성장을 구별하려면 바이오매스 측정에서 6% 미만의 정확도가 필요하며 이는 간섭계를 사용해도 대부분의 QPM 방법으로는 달성할 수 없습니다.Zur et al. 53에 따르면, 지수 성장과 (이)선형 성장을 구별하려면 바이오매스 측정에서 6% 미만의 정확도가 필요하며 이는 간섭계를 사용하는 경우에도 대부분의 QPM 방법에서는 달성할 수 없습니다. CGM은 바이오매스 측정36,48에서 pg 이하의 정확도로 이러한 정확도를 달성합니다.
6개의 OT 이미지(오일 침지, 60x, NA 목표 1.25)로 구성된 시간 경과 및 (b) CGM으로 측정된 마이크로 CFU 바이오매스 진화. 자세한 내용은 영화 M7을 참조하세요.
S. shibatae의 완벽한 선형 성장은 예상치 못한 것이며 아직 보고되지 않았습니다. 그러나 적어도 시간이 지남에 따라 2, 4, 8, 16… 세포의 다중 분열이 발생해야 하기 때문에 기하급수적인 성장이 예상됩니다. 우리는 세포 밀도가 너무 높을 때 세포 성장이 느려지고 결국 휴면 상태에 도달하는 것과 마찬가지로 조밀한 세포 패킹으로 인한 세포 억제로 인해 선형 성장이 발생할 수 있다는 가설을 세웠습니다.
우리는 가열량 감소, 열 관성 감소, 금 나노 입자에 대한 관심, 정량적 위상 현미경에 대한 관심, LA-HTM을 사용할 수 있는 가능한 온도 범위 등 5가지 관심 사항을 차례로 논의함으로써 결론을 내립니다.
저항 가열과 비교하여 HTM 개발에 사용되는 레이저 가열은 몇 가지 장점을 제공하며, 이는 본 연구에서 설명됩니다. 특히, 현미경 시야의 액체 매질에서 가열 부피는 수(10μm) 3 부피 이내로 유지됩니다. 이러한 방식으로 관찰된 미생물만 활성화되고 다른 박테리아는 휴면 상태이므로 샘플을 추가로 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 새로운 온도를 확인해야 할 때마다 샘플을 변경할 필요가 없습니다. 또한, 마이크로 스케일 가열을 통해 광범위한 온도를 직접 검사할 수 있습니다. 그림 4c는 3시간짜리 영화(Movie M3)에서 얻은 것으로 일반적으로 연구 중인 각 샘플에 대해 여러 샘플을 준비하고 검사해야 합니다. y는 실험의 일수를 나타내는 온도입니다. 가열된 부피를 줄이면 현미경의 모든 주변 광학 구성 요소, 특히 대물 렌즈가 실온으로 유지되는데, 이는 지금까지 커뮤니티가 직면한 주요 문제였습니다. LA-HTM은 유침 렌즈를 포함한 모든 렌즈와 함께 사용할 수 있으며 시야의 극한 온도에서도 실온을 유지합니다. 본 연구에서 보고하는 레이저 가열 방법의 주요 한계는 부착되지 않거나 부유하지 않는 세포가 시야에서 멀리 떨어져 연구하기 어려울 수 있다는 것입니다. 해결 방법은 낮은 배율 렌즈를 사용하여 수백 미크론을 초과하는 더 큰 온도 상승을 달성하는 것입니다. 이러한 주의는 공간 해상도 감소를 동반하지만, 미생물의 움직임을 연구하는 것이 목적이라면 높은 공간 해상도는 필요하지 않습니다.
시스템을 가열(및 냉각)하는 시간 척도 \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\)는 크기에 따라 다릅니다. 법칙에 따르면 \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), 여기서 \ (L\)은 열원의 특성 크기(우리 연구에서 레이저 빔의 직경은 \(L\ 약 100\)μm입니다.), \(D\)는 환경의 열 확산율(우리 연구의 평균)입니다. 케이스, 유리 및 물 확산 속도\(D\ 약 2\fold {10}^{-7}\) m2/s) 따라서 본 연구에서는 50 ms 정도의 시간 응답, 즉 준순간적입니다. 이러한 즉각적인 온도 상승 설정은 실험 기간을 단축할 뿐만 아니라 온도 효과에 대한 동적 연구를 위한 정확한 타이밍 \(t=0\)을 허용합니다.
우리가 제안한 방법은 모든 광 흡수 기판(예: ITO 코팅이 된 상업용 샘플)에 적용 가능합니다. 그러나 금 나노입자는 적외선에서 높은 흡수를 제공하고 가시광선에서 낮은 흡수를 제공할 수 있으며, 후자의 특성은 특히 형광을 사용할 때 가시광선에서 효과적인 광학 관찰에 중요합니다. 또한 금은 생체 적합하고 화학적으로 불활성이며 광학 밀도를 530nm에서 근적외선까지 조정할 수 있으며 시료 준비가 간단하고 경제적입니다29.
가로 격자 파면 현미경(CGM)을 사용하면 미세 규모의 온도 매핑뿐만 아니라 바이오매스 모니터링도 가능하므로 LA-HTM과 함께 사용하면 특히 유용합니다(필요하지 않은 경우). 지난 10년 동안 특히 바이오이미징 분야에서 다른 온도 현미경 기술이 개발되었으며 대부분 온도에 민감한 형광 프로브를 사용해야 합니다54,55. 그러나 이러한 방법은 비판을 받아 왔으며 일부 보고서에서는 형광이 온도 이외의 많은 요인에 따라 달라지기 때문에 세포 내에서 비현실적인 온도 변화를 측정했습니다. 또한 대부분의 형광 프로브는 고온에서 불안정합니다. 따라서 QPM, 특히 CGM은 광학 현미경을 사용하여 고온에서의 생명을 연구하기 위한 이상적인 온도 현미경 기술을 나타냅니다.
80°C에서 최적으로 사는 S. shibatae에 대한 연구는 LA-HTM이 단순한 호열성 생물뿐만 아니라 고열성 생물을 연구하는 데 적용될 수 있음을 보여줍니다. 원칙적으로 LA-HTM을 사용하여 도달할 수 있는 온도 범위에는 제한이 없으며 대기압에서 100°C 이상의 온도도 끓이지 않고 도달할 수 있습니다. 압력 A. 금나노입자(40)를 가열하는데도 같은 방법으로 레이저를 사용한다. 따라서 LA-HTM은 표준 조건(즉, 환경 스트레스 하)에서 표준 고해상도 광학 현미경을 사용하여 전례 없는 고열균체를 관찰하는 데 사용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
모든 실험은 Köhler 조명(LED, M625L3, Thorlabs, 700mW 포함), 수동 xy 이동이 가능한 표본 홀더, 대물렌즈(Olympus, 60x, 0.7 NA, 공기, LUCPlanFLN60X 또는 60x, 1.25 NA, 오일 포함)를 포함한 수제 현미경을 사용하여 수행되었습니다. , UPLFLN60XOI), CGM 카메라(QLSI 교차 격자, 39μm 피치, Andor Zyla 카메라 센서의 0.87mm)는 강도 및 파면 이미징을 제공하고 sCMOS 카메라(ORCA Flash 4.0 V3, 16비트 모드, Hamamatsu의)를 기록합니다. 그림 5에 표시된 데이터(박테리아 수영). 이색성 빔 스플리터는 749nm BrightLine 에지(Semrock, FF749-SDi01)입니다. 카메라 전면의 필터는 694 쇼트 패스 필터(FF02-694/SP-25, Semrock)입니다. 티타늄 사파이어 레이저(레이저 Verdi G10, 532nm, 10W, 펌핑된 쓰나미 레이저 캐비티, 그림 2-5의 Spectra-Physics, 그림 2의 경우 Millenia 레이저, Spectraphysics 10W, 펌핑된 Mira 레이저 캐비티, Coherent로 대체됨) -5). 6 및 7)은 금 나노입자의 플라즈몬 공명 스펙트럼에 해당하는 파장 \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\)nm로 설정됩니다. 공간 광 변조기(1920 × 1152 픽셀)은 Meadowlark Optics에서 구입했습니다. 홀로그램은 링크 39에 설명된 대로 Gerchberg-Saxton 알고리즘을 사용하여 계산되었습니다.
교차 격자 파면 현미경(CGM)은 기존 카메라 센서에서 1mm 거리에 있는 2차원 회절 격자(교차 격자라고도 함)를 결합하는 광학 현미경 기술입니다. 이 연구에서 사용한 CGM의 가장 일반적인 예는 4파장 횡편이 간섭계(QLSI)입니다. 여기서 교차 격자는 Primot et al.이 도입하고 특허한 강도/위상 체커보드 패턴으로 구성됩니다. 수직 및 수평 격자선은 센서에 격자 모양의 그림자를 생성하며, 그 왜곡은 실시간으로 수치적으로 처리되어 입사광의 광학 파면 왜곡(또는 등가 위상 프로파일)을 얻을 수 있습니다. 현미경에서 사용하는 경우 CGM 카메라는 광학 깊이(OT)라고도 알려진 이미지 개체의 광학 경로 차이를 나노미터 정도의 감도로 표시할 수 있습니다. 모든 CGM 측정에서 광학 구성 요소나 빔의 결함을 제거하려면 기본 참조 OT 이미지를 가져와서 후속 이미지에서 빼야 합니다.
참고 문헌에 설명된 대로 CGM 카메라를 사용하여 온도 현미경 검사를 수행했습니다. 32. 즉, 액체를 가열하면 굴절률이 변경되어 입사 광선을 왜곡하는 열 렌즈 효과가 생성됩니다. 이 파면 왜곡은 CGM으로 측정되고 디콘볼루션 알고리즘을 사용하여 처리되어 액체 매질의 3차원 온도 분포를 얻습니다. 금 나노입자가 샘플 전체에 고르게 분포되어 있으면 박테리아가 없는 영역에서 온도 매핑을 수행하여 더 나은 이미지를 생성할 수 있으며, 이는 우리가 가끔 수행하는 작업입니다. 참조 CGM 이미지는 가열 없이(레이저를 끈 상태에서) 획득한 후 레이저를 켠 상태에서 이미지의 동일한 위치에서 캡처했습니다.
건량 측정은 온도 이미징에 사용된 것과 동일한 CGM 카메라를 사용하여 수행됩니다. CGM 참조 이미지는 박테리아의 존재로 인한 OT의 불균일성을 평균화하는 수단으로 노출 중에 샘플을 x 및 y로 빠르게 이동하여 얻었습니다. 박테리아의 OT 이미지에서 참고문헌에 설명된 절차에 따라 Matlab의 자체 분할 알고리즘(하위 섹션 "수치 코드" 참조)을 사용하여 선택된 영역에 대한 이미지 앙상블을 사용하여 박테리아의 바이오매스를 얻었습니다. 48. 즉, \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} 관계를 사용합니다. } x{{\mbox{d}}}y\), 여기서 \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\)는 광학 깊이 이미지이고, \(m\)은 건조 중량과 \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\)는 상수입니다. 우리는 살아있는 세포의 일반적인 상수인 \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg를 선택했습니다.
금 나노입자로 코팅된 직경 25mm, 두께 150μm의 커버 슬립을 금 나노입자가 위로 향하도록 AttofluTM 챔버(Thermofisher)에 배치했습니다. Geobacillus stearothermophilus를 매일 실험 전 LB 배지(200rpm, 60°C)에서 밤새 전배양했습니다. 광학 밀도(OD)가 0.3~0.5인 G. stearothermophilus 현탁액 5μl를 금 나노입자가 포함된 커버 슬립 위에 놓았습니다. 그 후, 중앙에 직경 5mm의 구멍이 있는 직경 18mm의 둥근 커버슬립을 방울 위에 떨어뜨리고, 동일한 흡광도를 갖는 박테리아 현탁액 5μl를 구멍의 중앙에 반복적으로 도포하였다. 커버슬립의 웰은 참고문헌에 설명된 절차에 따라 준비되었습니다. 45 (자세한 내용은 보충 정보 참조). 그런 다음 액체 층이 건조되는 것을 방지하기 위해 커버슬립에 LB 배지 1ml를 추가합니다. 마지막 커버슬립은 Attoflur™ 챔버의 닫힌 뚜껑 위에 놓아 배양 중 배지 증발을 방지합니다. 발아 실험을 위해 우리는 포자를 사용했는데, 이는 기존 실험 후에 때때로 상단 커버슬립을 덮었습니다. 유사한 방법을 사용하여 Sulfolobus shibatae를 얻었습니다. Thiobacillus serrata의 예비 배양을 배지 182(DSMZ)에서 3일(200rpm, 75°C) 동안 수행했습니다.
금 나노입자 샘플은 미셀 블록 공중합체 리소그래피를 통해 준비되었습니다. 이 프로세스는 챕터에서 자세히 설명됩니다. 60. 간단히 말해서, 금 이온을 캡슐화하는 미셀은 톨루엔에 HAuCl4와 공중합체를 혼합하여 합성되었습니다. 세척된 커버슬립을 용액에 담그고 환원제 존재 하에 UV 조사로 처리하여 금 종자를 얻었다. 마지막으로 커버슬립을 KAuCl4 및 에탄올아민 수용액과 16분간 접촉시켜 금 종자를 성장시켰는데, 그 결과 근적외선에서 비구형 금 나노입자가 준주기적이고 매우 균일하게 배열되었습니다.
인터페로그램을 OT 이미지로 변환하기 위해 링크에 자세히 설명된 대로 직접 만든 알고리즘을 사용했습니다. 33이며 다음 공개 저장소에서 Matlab 패키지로 제공됩니다: https://github.com/baffou/CGMprocess. 이 패키지는 기록된 간섭계(참조 이미지 포함)와 카메라 배열 거리를 기반으로 강도 및 OT 이미지를 계산할 수 있습니다.
주어진 온도 프로파일을 얻기 위해 SLM에 적용되는 위상 패턴을 계산하기 위해 이전에 개발된 자체 알고리즘39,42을 사용했습니다. 이 알고리즘은 다음 공개 저장소에서 사용할 수 있습니다: https://github.com/baffou/SLM_tempShaping. 입력은 원하는 온도 필드이며, 디지털로 설정하거나 흑백 bmp 이미지를 통해 설정할 수 있습니다.
세포를 분할하고 건조 중량을 측정하기 위해 우리는 다음 공개 저장소에 게시된 Matlab 알고리즘을 사용했습니다: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. 각 이미지에서 사용자는 관심 있는 박테리아 또는 mCFU를 클릭하고 막대 감도를 조정한 후 선택을 확인해야 합니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사에 링크된 Nature Research Report 요약을 참조하세요.
이 연구 결과를 뒷받침하는 데이터는 합당한 요청이 있을 경우 각 저자에게 제공됩니다.
이 연구에 사용된 소스 코드는 방법 섹션에 자세히 설명되어 있으며, 디버그 버전은 https://github.com/baffou/ SLM_temporationShaping, CGMprocess 및 CGM_magicWandSegmentation 리포지토리에서 다운로드할 수 있습니다.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 호열성 물질 및 광범위한 스펙트럼 적용에 대한 통찰력. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 호열성 물질 및 광범위한 스펙트럼 적용에 대한 통찰력.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. 및 Sharma, AK 호열성 물질 및 그 광범위한 적용 개요. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应용. 메타, R., 싱할, P., 싱, H., 담레, D. & 샤르마, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. 및 Sharma AK 호열성 물질과 다양한 응용 분야에 대한 깊은 이해.3 생명공학 6, 81(2016).
게시 시간: 2022년 9월 26일